离子液体与重组工程菌的生物相容性研究及在手性合成中的应用

樊淼 ，张溶津，刘 琤，李 军

（杭州医学院，浙江 杭州 310053）

随着非水酶学的发展，生物催化技术已广泛用于合成手性药物[1-3]。由于水相催化出现诸如水难溶底物溶解性差，底/产物的细胞毒性等问题，制约着生物合成领域的发展[4-6]。近年来，作为环境友好的绿色溶剂，离子液体为生物催化反应提供了不同于水相和传统有机溶剂的介质环境，因其独特的化学性质使基于离子液体介质生物催化成为近年来医药化工的研究热点之一[7-8]。离子液体种类较多，但适于构建生物合成手性药物反应体系的离子液体种类较少，而离子液体的生物相容性研究是开发适于生物催化离子液体的关键。研究表明，部分离子液体对微生物细胞生长具有抑制作用，影响细胞代谢及细胞膜完整性，因此离子液体生物相容性研究十分必要[9-12]。采用离子液体构建生物合成反应体系时，应考虑离子液体的生物相容性，研究离子液体对细胞的毒性、细胞存活率及代谢活性等因素。通过不同种类离子液体对微生物细胞的生物相容性研究，得出离子液体结构与其生物相容性之间的构效关系，从而构建高效反应体系用于生物合成手性药物。

1 实验部分

1.1 主要实验仪器及设备

生化培养箱（SHP-150），立式压力蒸汽灭菌器（MLS-3750），生物安全柜（HF1200），恒温摇床（TS-200B），电子天平 （AL204），多功能酶标仪（SpectraMax M2e），安捷伦气相色谱仪（7820A）。

1.2 主要试剂

E.coli BL21（DE3）为本实验室构建基因重组菌，基因序列ScCR （GenBank Accession No.NC 003888.3）由上海生工合成；葡萄糖测定试剂盒，4-氯乙酰乙酸乙酯，（R）-3-羟基丁酸乙酯及其它化学试剂均为市售化学纯、分析纯或生化试剂。

1.3 离子液体种类

实验中所用离子液体见表1。

表1 实验离子液体种类与缩写Table 1 Ionic liquids used in the experiment

1.4 细胞糖代谢活力测定

离子液体对细胞代谢活性的影响可由菌体细胞的糖代谢保留值来表征。细胞代谢活性保留定义为：经离子液体处理后的细胞糖代谢率与未经离子液体处理（即空白对照）的细胞糖代谢率的比值。具体实验过程如下：0.1 g E.coli BL21（DE3） 菌体悬浮于 20 mL PBS （Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5）中，再加入适量离子液体，以不加离子液体组为空白对照，在30℃，200 rpm条件下24 h；取出菌悬液，收集菌体，经蒸馏水洗涤后，加入10 g/L葡萄糖水溶液20 mL，继续在摇床30℃，200 r/min条件下恒温保持4 h，8000 rpm离心10 min收集上清液，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测得残糖，以此计算4 h内细胞的糖代谢率。

1.5 细胞膜通透性测定

0.1 g E.coli BL21（DE3）菌体悬浮于含一定量含离子液体的 PBS溶液中（Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5），以不含离子液体的PBS为对照，于30℃，200 r/min条件下孵化6 h。8000 r/min离心10 min，收集上清液。检测260 nm和280 nm处吸光值以确定样品中核酸和蛋白质的含量，即可得出离子液体对细胞膜通透性的影响。

1.6 E.coli BL21（DE3）催化不对称还原反应及气相色谱分析法

反应体系：0.1 g E.coli BL21（DE3）菌体于250 mL摇瓶中，并在 20 mL PBS（Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5）中悬浮细胞，加入 20% （v/v）异丙醇，添加4-氯乙酰乙酸乙酯底物，构建含离子液体介质体系时，亲水性离子液体添加量为5%（v/v）， 疏水性离子液体添加量为 15% （v/v），于30℃、200 r/min的摇床中反应24 h。

气相色谱分析方法：底物和产物检测采用气相色谱法。气相色谱条件：安捷伦GC-7820A气相色谱仪，色谱柱为Varian CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱 （25 m×0.25 mm×0.25 μm， df=0.25）。载气为氮气，流量为2.0 mL/min；色谱柱温度90℃ ～150℃；升温速度：10℃/min；检测器和进样口温度均为250℃，检测器为FID；进样量1 μL，分流比为 20 ∶1。

2 结果与讨论

2.1 亲水性离子液体对E.coli BL21（DE3）糖代谢能力影响

图1 亲水性离子液体对E.coli BL21（DE3）糖代谢能力的影响Fig.1 Effect of hydrophilic ILs on sugar metabolic activity retention （MAR） of E.coli BL21（DE3）

离子液体由于其不易挥发、溶解能力强等特性，通常被认为是绿色溶剂，而不同离子液体对生物催化剂的毒性不同。首先研究咪唑、吡啶等八种亲水性离子液体对重组基因工程菌E.coli BL21（DE3）细胞糖代谢活力的影响，结果如图1所示。当离子液体的阴离子相同时，离子液体阳离子对细胞的毒性顺序为：[N2，2，2，2]+＜ [Epy]+＜[EMMP]+＜ [P1，2]+＜ [EMIM]+＜ [PP1，4]+＜ [DMIM]+＜[BMIM]+。以上研究结果表明，八种亲水性离子液体对E.coli BL21（DE3）细胞均有毒性，其中季铵型离子液体[N2，2，2，2][BF4]对细胞糖代谢能力影响最小，其次是吡啶类和吗啉类离子液体。

2.2 亲水性离子液体对E.coli BL21（DE3）细胞膜通透性影响

离子液体可改善细胞膜的通透性，在反应体系中添加离子液体可提高底/产物发生酶促反应速率，并减少底/产物抑制。离子液体对细胞膜通透性影响研究结果如图2所示，八种离子液体均可增加细胞膜通透性，但也增加了细胞死亡率。与对照相比，含[N2，2，2，2][BF4]体系可适度增加细胞膜通透性，且季铵盐离子液体的细胞糖代谢能力较佳。 因此，[N2，2，2，2][BF4]被认为是生物相容性较好的反应体系可用于生物合成。

表2 亲水性离子液体对细胞膜透性的影响Table 2 Effect of various hydrophilic ionic liquids on cell membrane permeability

2.3 亲水性离子液体对E.coli BL21（DE3）催化还原反应影响

生物相容性实验结果表明，季铵盐离子液体[N2，2，2，2][BF4]对 E.coli BL21 （DE3） 细胞具有较好的生物相容性。含该离子液体介质中E.coli BL21（DE3）生物不对称催化还原制备（R）-3-羟基丁酸乙酯反应效率如表3所示。与对照相比，含[N2，2，2，2][BF4]、[PP1，4][BF4]、[EMIM][BF4]离子液体介质反应体系可有效提高生物催化产率，基于不同离子液体介质中E.coli BL21（DE3）催化效率如下：[N2，2，2，2][BF4]＞ [PP1，4][BF4]＞ [EMIM][BF4]＞[EMMP][BF4]＞[BMIM][BF4]＞[Epy][BF4]＞[DMIM][BF4]＞ [P1，2][BF4]。以上研究结果表明，亲水性离子液体的生物相容性规律与催化效率不完全一致，但生物相容性最好的季铵型离子液体[N2，2，2，2][BF4]的催化效率最高，达 97.1%，ee 值为99%。

表3 亲水性离子液体对生物不对称还原反应的影响Table 3 Effect of various hydrophilic ILs on the biocatalytic reaction

2.4 疏水性离子液体对E.coli BL21（DE3）细胞糖代谢活力影响

图2 疏水性离子液体对E.coli BL21（DE3）糖代谢能力影响Fig.2 Effect of hydrophobic ILs on MAR of E.coli BL21（DE3）

由于反应底物多为水难溶性化合物，而疏水性离子液体可增加底物在反应体系中的溶解性。因此，研究不同种类疏水性离子液体对E.coli BL21（DE3）糖代谢活力影响，结果如图2所示。当离子液体的阴离子相同时，离子液体阳离子对细胞的毒性顺序为：[N2，2，2，2]+＜ [Epy]+＜ [EMMP]+＜ [P1，2]+＜ [EMIM]+＜ [PP1，4]+＜ [DMIM]+＜[BMIM]+。结果与亲水性离子液体对E.coli BL21（DE3）糖代谢活力影响规律一致，季铵型离子液体的生物相容性最好。

2.5 疏水性离子液体对E.coli BL21（DE3）细胞膜通透性影响

不同疏水性离子液体对细胞膜通透性影响结果如表4所示，与亲水性离子液体相比，疏水性离子液体更能增加细胞膜通透性，但细胞毒性随之增加，尤其以咪唑类离子液体毒性最大，其可能已导致细胞死亡。与对照相比，[N2，2，2，2][PF6]与亲水性离子液体[N2，2，2，2][BF4]一样，可适度增加细胞膜通透性，增加底物发生酶促反应效率。

表4 疏水性离子液体对细胞膜通透性的影响Table 4 Effect of various hydrophobic ILs on cell membrane permeability

2.6 疏水性离子液体对E.coli BL21（DE3）催化反应影响

疏水性离子液体可通过增加水难溶性底物的溶解性提高生物合成效率，结果如表5所示。与对照相比， 体系中添加 [PP1，4][PF6]和[N2，2，2，2][PF6]两种离子液体可提高不对称还原效率。 且当体系中添加[N2，2，2，2][PF6]后，产物产率达最高，表现出较好的催化性能。所有离子液体对手性化合物ee值无影响。

3 结论

通过细胞糖代谢能力和细胞膜通透性研究了不同离子液体与重组工程菌E.coli BL21（DE3）的生物相容性，并构建基于离子液体介质生物催化不对称还原反应体系，并研究其催化性能。研究结果表明季胺型离子液体[N2，2，2，2][BF4]是生物相容性最好的溶剂，且催化性能最佳。通过对离子液体的生物相容性研究，为构建高效生物合成手性药物反应体系提供参考，从而推动手性药物高效合成新技术快速发展。

表5 疏水性离子液体对E.coli BL21（DE3）催化反应的影响Table 5 Effect of various hydrophobic ILs on biocatalytic reaction

[1] Ma S K，Gruber J，Davis C，et al.A green-by-design biocatalytic process for atorvastatin intermediate[J].Green Chem，2010，12：81-86.

[2] Desai A A.Sitagliptin manufacture：a compelling tale of green chemistry， process intensi fication， and industrial asymmetric catalysis[J].Angew Chem Int Ed， 2011， 50：1974-1976.

[3] Ghislieri D，Green A P，Pontini M，et al.Engineering an enantioselective amine oxidase for the synthesis of pharmaceutical building blocks and alkaloid natural products[J].J Am Chem Soc， 2013， 135： 10863-10869.

[4] Patel R N.Biocatalytic synthesis of intermediates for the synthesis of chiral drug substances[J].Curr Opin Biotechnol， 2001， 12 （6）： 587-604.

[5] Solano D M， Hoyos P， Hernáiz M J， et al.Industrial biotransformations in the synthesis of building blocks leading to enantiopure drugs[J].Bioresourc technol， 2012， 115：196-207.

[6]Matsuda T，Yamanaka R，Nakamura K.Recent progress in biocatalysis for asymmetric oxidation and reduction[J].Tetrahedron Asymmetr， 2009， 20 （5）： 513-557.

[7] Dai L Y，Yu S Y，Shan Y K，et al.Novel room temperature in organic ionic liquids[J].Eur J Inorg Chem，2010，2004 （2）： 237-241.

[8] Petkovic M，Ferguson J，Bohn A，et al.Exploring fungal activity in the presence of ionic liquids[J].Green Chem，2009，11： 889-894.

[9] Cull S G，Holbrey J D，Vargas-Mora V，et al.Roomtemperature ionic liquids as replacements for organic solvents in multiphase bioprocess operations[J].Biotechnol Bioeng， 2000， 69： 227-233.

[10]Bräutigam S， Dennewald D， Schürmann M， et al.Wholecell biocatalysis：Evaluation of new hydrophobic ionic liquids for efficient asymmetric reduction of prochiral ketones[J].Enzym Microb Technol， 2009， 45： 310-316.

[11]Xu P，Zheng G W，Du P X，et al.Whole-cell biocatalytic processes with ionic liquids[J].ACS Sustainable Chem Eng，2016，4：371-386.

[12]Tao Y，Dong R，Pavlidis I V，et al.Using imidazoliumbased ionic liquids as dual solvent catalysts for sustainable synthesis of vitamin esters：inspiration from bio-and organo-catalysis[J].Green Chem，2016，18：1240-1248.