高效液相色谱法测定碳酸饮料中苯甲酸和山梨酸的含量

2018-02-03廖鹏

浙江化工 2018年1期

廖鹏

（成都理工大学材料与化学化工学院，四川成都 610059）

0 引言

苯甲酸、山梨酸及其盐用作食品防腐剂，广泛应用于日常食品。苯甲酸及其钠盐具有抗菌作用。通常情况下，苯甲酸被认为是安全的。然而，苯甲酸的长期摄入也可能与哮喘，荨麻疹，代谢性酸中毒及其他不良反应有关，包括婴儿和儿童[1]。山梨酸（钾）可以有效抑制霉菌等细菌的活性，并且比杀菌更有效抑制细菌生长，有效延长食品的保存期限。随着我国食品工业的发展，在食品加工过程中对食品防腐剂需求日益增长，一些商人为追求更高的利润，甚至过量添加食品防腐剂。有资料表明过量使用苯甲酸和山梨酸可引起再生障碍性贫血，粒状细胞缺乏[2]。因此，国家严格限制其使用量。

目前，苯甲酸、山梨酸的测定方法主要有气相色谱法[3]、高效液相色谱法[4]、离子色谱法[5]、紫外分光光度法[6]等方法。高效液相色谱（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法，高压泵，高效固定相和高灵敏度检测仪等先进技术，具有分析速度快，分离效率高，灵敏度高，操作自动化，应用范围广等特点[7]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津股份有限公司）；DZKW-S-8电热恒温水浴锅（北京光明医疗仪器厂）；电子分析天平（DT200，成都俊鸿达科技有限公司）；甲醇（色谱纯）；乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取 1.54 g 乙酸铵，加水至 1000 mL溶解后经 0.45 μm 滤膜过滤；稀氨水（1+1）：氨水和水等体积混合；碳酸氢钠溶液（20 g/L）：称取2 g碳酸氢钠（优级纯），加水至100 mL后振摇溶解；苯甲酸、山梨酸标准品；碳酸饮料样品：芬达橙味汽水（瓶装600 mL）。实验用水均为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

苯甲酸标准溶液：准确称取0.1000 g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液（20 g/L）5 mL，加热溶解，定容至100 mL，苯甲酸含量为1.0 mg/mL。山梨酸标准溶液配制同苯甲酸。

苯甲酸、山梨酸标准混合溶液：取苯甲酸、山梨酸标准溶液各10.0 mL至100 mL容量瓶中。溶液含苯甲酸、山梨酸标准溶液各0.1 mg/mL。经0.45 μm 滤膜过滤。

1.3 色谱条件

色谱柱为 Thermo-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为 1.54 g/L 的乙酸铵-甲醇（体积比 85：15），流速为 1.0 mL/min，检测波长为230 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。

1.4 样品前处理

碳酸饮料：在电子分析天平上准确称取碳酸饮料样品两份于小烧杯中，质量分别为m1=8.0100 g；m2=8.0403 g，经恒温水浴锅加温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调节pH≈7。加水定容体积V为50 mL。经微孔过滤膜（0.45 μm）过滤后，滤液待测。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

流动相会影响色谱组分的分离分析过程，是色谱分析中分离的一个非常重要的调节因素，正确地选择流动相将直接影响到组分的分离度与灵敏度[8]。本实验用甲醇—乙酸铵溶液（1.54 g/L）考察在甲醇—乙酸铵溶液不同比例下（5∶95、10∶90、15∶85）各种物质的分离情况，发现在甲醇—乙酸铵体积比为85∶15时效果最佳，各物质间能很好地分离，分离效果较好，基线比较平稳。故本实验采用此流动相体系对样品进行测定。

2.2 柱温的选择

柱温直接影响分离效能和分析速度，柱温过高会使各组分的挥发度靠拢，保留值差别缩小，不利于分离，所以从分离的角度考虑，宜采用较低的柱温。但柱温太低，被测组分在两相中的扩散速率减小，分配不能迅速达到平衡，峰形变宽，柱效下降，并延长了分析时间。实验时考察了不同柱温下（25℃、30℃、35℃ ）各峰的分离情况，结果表明，在30℃的条件下，各峰的分离效果最佳，故选择30℃为柱温。

2.3 检测波长的选择

用紫外可见光分光光度计测量苯甲酸、山梨酸在200～400 nm下的吸光度A，根据相关文献记载[9]，苯甲酸、山梨酸最大吸收峰的波长为225 nm，254 nm。本实验对230 nm、240 nm、254 nm三个波长进行试验，发现在波长230 nm下苯甲酸和山梨酸均有较理想的吸收，因此本实验选用230 nm作为检测波长。在该条件下对苯甲酸和山梨酸标准溶液进行色谱分析。

2.4 色谱图

取1.2配制的苯甲酸、山梨酸标准溶液，用1.4处理好的样品1，样品2的溶液在1.3的色谱条件下进样测定，分别得色谱图如图1、图2和图3所示。

图1 苯甲酸、山梨酸的标准溶液色谱图

图2 样品1的色谱图

图3 样品2的色谱图

2.5 标准曲线与检出限

标准曲线的绘制：取10 mL的比色管，再分别加入苯甲酸、山梨酸的标准溶液（1.0 mg/mL）配制成浓度为 0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的系列标准使用液。分别进样10 μL，依次进行测定，绘制标准工作曲线，苯甲酸的线性关系方程为Y=464.15X-2.8831，山梨酸的线性关系方程为Y=824.91X-3.5755，均能得到良好的线性关系。苯甲酸和山梨酸在0.25～100 mg/L内线性良好，相关系数分别为0.9970和0.9995。检出限均为0.5 mg/L。

2.6 测定结果计算方法

式中：X—试样中苯甲酸或山梨酸含量，g/kg；C—试样检测浓度，mg/mL；M—试样质量，g；V—试样总体积，mL。

表1 样品检测结果

表1中：C1—样品1苯甲酸检测浓度，mg/mL；

C1｀—样品 2苯甲酸检测浓度，mg/mL；

C2—样品1山梨酸检测浓度，mg/mL；

C2｀—样品 2山梨酸检测浓度，mg/mL；

X1—样品1中苯甲酸含量，g/kg；

X1｀—样品 2中苯甲酸含量，g/kg；

X2—样品1中山梨酸含量，g/kg；

X2｀—样品 2中山梨酸含量，g/kg；

X1—2份样品中苯甲酸的平均含量，g/kg；

X2—2份样品中山梨酸的平均含量，g/kg；

2.7 加标回收率

按1.4预处理样品，分别加入0.02 mg/mL，0.1 mg/mL浓度的苯甲酸、山梨酸标准混合溶液，平行测定2次，测定结果见表2。

3 结论

本实验采用高效液相色谱法同时测定饮料中苯甲酸和山梨酸的含量，甲醇与乙酸铵的比例为15：85，柱温：30℃。实验结果表明各苯甲酸的加标回收率在 86.5%～105%之间，RSD＜3.8%，山梨酸的加标回收率在 99%～103.4%之间，RSD＜4.3%。采用不同浓度的系列混合标准溶液制作标准曲线，获得较好的线性关系。该方法检测苯甲酸和山梨酸的检出限为0.5 mg/L。回收率较好，有较高的实用价值。