三种抗菌药物对羊源大肠杆菌抗菌活性的研究

邵莉萍+李宏胜+妥鑫

摘要：采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），研究抗菌药物恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星对21株羊源大肠杆菌临床分离株的体外抗菌活性，从而观察大肠杆菌对几类抗菌药物的敏感性。结果表明，大肠杆菌对恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星的敏感率分别为0.00、66.7%、61.9%，耐药率分别为47.6%、14.3%、33.3%。恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星均对大肠杆菌产生不同程度的耐药性，其中恩诺沙星耐药性最强，而环丙沙星耐药性最弱。

关键词：恩诺沙星；加替沙星；环丙沙星；大肠杆菌；耐药性：敏感性

中图分类号：S859.79+6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）01-0086-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.022

Abstract： The broth microdilution method is used to determine MIC，which aims to evaluate the activity of the Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin against the clinical Escherichia coli from sheeps（21 isolates），and the susceptible and resistance of the enrofloxacin，gatifloxacin and ciprofloxacin against E.coli was estimated. Result showed that，drugs susceptiblerates to Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin in E.coli are 0.00，66.7%，61.9%， and the drugs resistance rates to Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin in E.coli are 47.6%，14.3%，33.3%. Enrofloxacin，Ciprofloxacin，Gatifloxacin emerge the different resistantance to E.coil. The E.coil strains showed high drug resistance to Enrofloxacin，and showed low drug resistance to Ciprofloxacin.

Key words： Enrofloxacin； Gatifloxacin； Ciprofloxacin； Escherichia coli； drug resistance； sensibility

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）俗称大肠杆菌，属埃希氏菌属（Escherichia），为人和动物肠道中的正常菌群之一。但是，在一定条件下，某些血清型的大肠杆菌会随着动物机体抵抗力低下而引起动物患病，特别是对于婴儿或者幼畜，常常引起严重腹泻和败血症[1]。E.coli作为食源性疾病的主要致病菌之一，不仅在发展中国家常发，发达国家也不例外，许多国家曾经都对其进行过相关的报道[2]。它常常伴随着动物的屠宰加工或者奶制品的原料采集和生產等过程进行感染，大量的数据证实食品动物和奶制品是致病性大肠杆菌（Diarrheagenic E. Coli，DEC）传播并导致人类或者动物发病的主要媒介，例如牛肉、猪肉、羊肉以及家禽肉，其肉制品或者奶制品携带DEC的概率大概为2.84%和0.75%[3]。

羊腹泻是羊养殖行业常见的肠道疾病之一，其主要致病菌之一为E.coil。羔羊作为易感群体，常常大规模发病，腹泻严重时，死亡率高达50%，给畜牧养殖行业造成巨大的经济损失[4，5]。但是，由于抗菌药物大量的滥用，使得羊源大肠杆菌产生耐药性，并且其耐药性逐年在增强。近几年，大肠杆菌的多重耐药菌株和交叉耐药菌株在临床上多次被分离和报道，尤其对青霉素和红霉素的耐药性可达到90%以上[6]。喹诺酮类化合物是一类人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌剂，对革兰氏阴性菌具有良好的抗菌活性和较强的药代学特性，自20世纪60年代问世以来，已经经历4代的结构改造与修饰，目前兽医临床常用的为第三代的环丙沙星（Ciprofloxacin）和恩诺沙星（Enrofloxacin）以及第四代的加替沙星（Gatifloxacin），其中恩诺沙星在兽医临床中应用最为广泛[7，8]。但是，自2000年以来，兽医临床上常见致病菌对喹诺酮类药物产生耐药性的现象在疾病的治疗中越发普遍，特别是肠道大肠杆菌的耐药性问题。为此，本文通过研究21株羊源大肠杆菌临床分离菌对喹诺酮类药物恩诺沙星、加替沙星、环丙沙星的耐药性，为兽医临床合理用药提供数据支持，从而避免临床大肠杆菌耐药问题的进一步恶化。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

恩诺沙星，纯度98%，由北京索莱宝科技有限公司提供；环丙沙星、加替沙星，纯度均为98%，均由上海麦克林生化科技有限公司提供。

CAMHB培养基购自青岛海博生物技术有限公司，新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 菌株

羊源大肠杆菌临床分离株21株，分离于甘肃省临夏某牛场；质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 29212，均购自美国组织培养库（ATCC）。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的配制 将液体培养基CAMHB按照产品要求配制一定体积的培养液，高压灭菌之后，置于4 ℃冰箱备用。endprint

1.3.2 抗菌药液的制备 试验前精密称取恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星，无菌操作配制成2 048 μg/mL的药液，置于4 ℃冰箱保存备用，临用前用相应的细菌培养液稀释至试验需要浓度。恩诺沙星、加替沙星用去离子水作溶剂，振荡30 min；环丙沙星用甲醇作溶剂，振荡30 min。

1.3.3 标准菌液制备 打开超净工作台，用无菌接种环挑取1个单菌落，接种至CAMHB液体培养基中，于37 ℃振荡培养5 h后，用无菌CAMHB培养基稀释菌液，直至菌液浓度为1×108 CFU/mL。

1.4 最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用微量肉汤稀释法分别测定待测药物对每株菌株的MIC，试验参考标准为美国临床和实验室标准协会（CLSI）[9，10]。将一定浓度的待测药物倍比稀释到96孔板各试验孔中，稀释梯度为13个梯度，浓度范围为0.0625～256 μg/mL。然后用无菌CAMHB培养液稀释已调节至1×108 CFU/mL浓度的菌液，稀释后的菌液在15 min内完成接种，保证每孔细菌的终浓度为5×105 CFU/mL，以及保证每孔对应的药物浓度分别为相应的13个梯度所对应的浓度。阴性对照组为接种了细菌的细菌培养液。当阴性对照组长出细菌时，试验结果方可采纳。

2 结果与分析

药物对21株羊源大肠杆菌的MIC结果见表1和表2。试验结果表明，恩诺沙星和环丙沙星的MIC50值相同，均为2 μg/mL，加替沙星的MIC50值略低于恩诺沙星和环丙沙星，为1 μg/mL，对于MIC90，除了环丙沙星为2 μg/mL之外，加替沙星和恩诺沙星相同，其值为≥32 μg/mL。

药物对21株羊源大腸杆菌的耐药率（Resistance）与敏感率（Susceptible）结果见表3。试验结果表明，羊源大肠杆菌对环丙沙星最敏感（66.7%），耐药率（14.3%）最低。对于加替沙星和恩诺沙星，羊源大肠杆菌对恩诺沙星不敏感（0.00），耐药性也是喹诺酮类药物当中最高的，为47.6%；对加替沙星的耐药率为33.3%，敏感率为61.9%。

3 小结与讨论

试验结果表明，喹诺酮类药物恩诺沙星对羊源大肠杆菌的耐药性最显著，为47.6%，并且对E. Coli不敏感；而环丙沙星对羊源大肠杆菌最敏感，其敏感率为66.7%，而耐药性仅为14.3%。由此可以发现，甘肃省临夏一带的羊源E. Coli对环丙沙星仍然具有一定的敏感性，对恩诺沙星却已经产生一定程度的耐药性。但是其他省份和地区有关大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性和敏感性报道却与本试验结果并不一致，说明大肠杆菌的耐药性呈现一定的区域特性。

由于大肠杆菌在中国各个地区均呈现出严重的耐药现状，且表现出地区差异性，耐药基因可以通过质粒水平进行传染，从而给养殖行业带来严重威胁。因此，为防止大肠杆菌耐药情形进一步扩大蔓延和加重，应该采取有效措施进行应对，比如联合科研机构根据大肠杆菌不同耐药机理进行新药创制，或者积极向相关部门反映情况，引起其重视，从而采取相应措施来加强耐药菌的检测，以减少更多耐药情况的恶化。

参考文献：

[1] 张海月，康元环，王姣姣，等.大肠杆菌生物被膜与耐药性的关系[J].中国兽药杂志，2015，49（6）：62-65.

[2] CROWE S J，MAHON B E，VIEIRA A R，et al. Vital signs： Multistate foodborne outbreaks-United States，2010-2014[J].Mmwr Morbidity & Mortality Weekly Report，2015，64（43）：1221.

[3] GONZ？魣LEZ J，SANSO A M，LUCCHESI P M，et al. Comparison of 2 proposed MLVA protocols for subtyping non-O157：H7 verotoxigenic Escherichia coli[J].Diagnostic Microbiology & Infectious Disease，2014，78（4）：328-332.

[4] MALUTA R P，FAIRBROTHER J M，STELLA A E，et al. Potentially pathogenic Escherichia coli，in healthy，pasture-raised sheep on farms and at the abattoir in Brazil[J].Veterinary Microbiology，2014，169（1-2）：89.

[5] 张希利，赵万军，晁旭东，等.致羔羊腹泻大肠杆菌的分离鉴定[J].新疆农垦科技，2016，39（2）：35-36.

[6] WANG L，NAKAMURA H，KAGENAKADAI E，et al. Prevalence，antimicrobial resistance and multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis profiles of diarrheagenic Escherichia coli isolated from different retail foods[J].International Journal of Food Microbiology，2017，249：44-52.

[7] CHENG G，HAO H，DAI M，et al. Antibacterial action of quinolones：from target to network[J].ChemInform，2013，66（42）：555-562.

[8] HOOPER D C，JACOBY G A. Mechanisms of drug resistance： quinolone resistance[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2015，1354（1）：12.

[9] WIEGAND I，HILPERT K，HANCOCK R E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration （MIC） of antimicrobial substances[J].Nature protocols，2008，3（2）：163-75.

[10] SADER H S，BIEDENBACH D J，PAUKNER S，et al. Antimicrobial activity of the investigational pleuromutilin compound BC-3781 tested against Gram-positive organisms commonly associated with acute bacterial skin and skin structure infections[J].Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2012，56（3）：1619-1623.endprint