健脾消癌方对转化生长因子—β1诱导的SW620细胞上皮间质转化的影响

罗吉+李勇敏+简小兰+罗燕+谭小宁+蒋益兰

摘要：目的 观察健脾消癌方对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的SW620细胞上皮间质转化的影响，探讨其防治结直肠癌的可能机制。方法 体外培养结直肠癌细胞SW620。CCK-8法和Transwell小室实验测定细胞增殖、侵袭及迁移能力，qRT-PCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin的基因和蛋白表达。结果 健脾消癌方药物血清能抑制SW620细胞体外增殖、迁移和侵袭能力；与空白组比较，TGF-β1诱导组细胞E-cadherin表达水平下降，Vimentin表达水平升高（P<0.05）；与TGF-β1诱导组比较，健脾消癌方+TGF-β1组细胞E-cadherin表达水平升高，Vimentin表达水平下降（P<0.05）。结论 健脾消癌方可通过调控TGF-β1诱导的SW620细胞上皮间质转化过程，抑制结肠癌的生长、侵袭和迁移能力，达到防止结直肠癌复发和转移的目的。

关键词：健脾消癌方；结直肠癌；肿瘤转移；上皮间质转化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.010

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0042-05

Effects of Jianpi Xiaoai Prescription on Epithelial-mesenchymal Transition of

Colorectal Cancer Cell SW620 Induced by TGF-β1

LUO Ji1， LI Yong-min1， JIAN Xiao-lan2， LUO Yan1， TAN Xiao-ning1， JIANG Yi-lan1

1. Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China；

2. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To observe the effects of Jianpi Xiaoai Prescription on epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cell SW620 induced by TGF-β1； To discuss its possible mechanism of action for prevention and treatment of colorectal cancer. Methods Colorectal cancer cells SW620 were cultured in vitro. By conducting CCK-8 and Transwell experiments， the proliferation， invasion and migration of colorectal cancer cell （SW620） were detected. qRT-PCR and Western blot experiments were applied to verify the mRNA and protein expression level of E-cadherin and Vimentin. Results Jianpi Xiaoai Prescription showed in vitro inhibitory effect on the proliferation， invasion and migration of colorectal cancer cell SW620. Compared with blank group， the expression of E-cadherin in TGF-β1 induced group was reduced and Vimentin was increased （P<0.05）； Meanwhile， the expression of E-cadherin in Jianpi Xiaoai Prescription group was increased and Vimentin was decreased when compared with TGF-β1 induced group （P<0.05）. Conclusion Jianpi Xiaoai Prescription can inhibit the proliferation， invasion and migration of colorectal cancer cell by reverting the epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cell induced by TGF-β1， with a purpose to achieve the goal of preventing and treating the recurring and migration of colorectal cancer.

Keywords： Jianpi Xiaoai Prescription； colorectal cancer； metastasis； epithelial-mesenchymal transition

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率位居消化道恶性肿瘤的第2位[1]。本课题组既往研究表明，健脾消癌方配合化疗能显著降低大肠癌的复发与转移，控制瘤体的生长，延长患者生存期，提高患者生存质量；能抑制结直肠癌裸鼠模型的肝转移率，但其具体作用机制还不甚清楚[2-4]。上皮间质转换（epithlial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象，被公认为影响CRC侵袭和转移的重要作用机制之一。在EMT过程中，上皮细胞标志蛋白E-cadeherin表达下调及间质细胞标志蛋白Vimentin表达上調，从而导致细胞极性发生改变、细胞骨架被重建、细胞间黏附出现不同程度的丧失以及肿瘤基底膜和细胞外基质均被不同程度破坏，从而使细胞获得高迁移、高侵袭、抗凋亡及降解细胞外基质等间质表型特征[5]。本实验采用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的CRC细胞SW620发生EMT，建立大鼠细胞EMT模型，探究健脾消癌方对SW620细胞EMT的作用及其抗肿瘤细胞迁移侵袭的可能机制。endprint

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠20只，7～8周龄，雌雄各半，体质量（200±20）g，湖南省长沙斯莱克实验动物中心，动物合格证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于温度（20±1）℃、相对湿度50%～70%环境，光照12 h/12 h明暗交替，自由摄食饮水。

1.2 细胞

SW620细胞，中国科学院上海细胞中心，培养于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM（高糖）培养液中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养基（GIBCO公司），胎牛血清（GIBCO公司），CCK-8（同仁化学研究所），PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara），SYBR-Green master（ROCHE），蛋白免疫印迹常规试剂（上海碧云天生物研究公司），E-cadherin、Vimentin一抗（Abcam公司），β-actin一抗（SIGMA公司），二抗抗体（中杉金桥公司）。细胞培养箱（Thermo公司），EIX808U型全自动酶标仪（BioTek），Hoefer SE300电泳，凝胶成像系统（Syngene），实时荧光定量PCR仪（ROCHE 480）。

1.4 健脾消癌方药物血清制备

健脾消癌方（人参10 g，薏苡仁30 g，重楼10 g，半枝莲30 g，莪术10 g，郁金15 g），饮片购自湖南省中医药研究院附属医院中药房。将2倍量处方药物用温水浸泡1 h，水量超出药物5～6 cm，大火煮沸后转小火煎30 min，趁热过滤，药渣再煎煮2次，将3次药液混匀、过滤，减压浓缩为含1.5 g原药材/mL，4 ℃保存，1周内用完。實验大鼠随机编号分为对照组和实验组，每组10只。实验组按相当于70 kg成人120 g/d的药物量（10.8 g/kg）灌胃；对照组按大鼠体质量灌胃等体积生理盐水。每日1次，连续6 d，于第7日最后1次灌胃后l h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血，4 ℃保存，2000 r/min离心10 min，吸取血清，合并同组动物血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，-20 ℃保存备用。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期SW620细胞，调整细胞数目为5×104/mL，按100 μL/孔接种于96孔板，培养24 h，吸去培养基，给予10%、15%、20%药物血清，10%、15%、20%空白血清，并设置阴性对照组（10%、15%、20%FBS），用培养基进行调零，每组5个复孔，实验重复3次。培养24、48 h后，每孔加入CCK8试剂10 μL，37 ℃孵育1.5 h，于酶标仪波长450 nm处测定OD值，计算细胞增殖抑制率[（对照组OD值-实验组OD值）÷对照组OD值×100%]。

1.6 分组

选择对数生长期的SW620细胞，按5×105/孔接种于60 mm培养皿中，每皿6 mL培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中过夜，次日更换新鲜培养基。实验分为空白对照组（DMEM培养基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1组（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培养基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1+健脾消癌方组（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培养基6 mL+15%健脾消癌方药物血清），每组设置3个重复，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养48 h。

1.7 细胞侵袭、迁移实验

应用Transwell小室（孔径8 μm）进行侵袭实验。首先制备含Matrigel胶的Transwell小室。实验预处理各组细胞：空白对照组（DMEM培养基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1组（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培养基6 mL+15%空白血清）、TGF-β1+健脾消癌方组（含TGF-β1 10 ng/mL的DMEM培养基6 mL+15%健脾消癌方药物血清），处理48 h，收集细胞，PBS清洗3次。用单DMEM培养基调整细胞浓度至1×106/mL，100 μL/孔接种于Transwell小室的上室，空白组小室下室加入含15%FBS的DMEM 1 mL作为诱导剂。细胞37 ℃、5%CO2常规培养24 h，取出小室，洗涤后甲醇固定20 min，风干，0.1%结晶紫染液染色20 min，显微镜下观察穿过小室的细胞数，拍照，计数。迁移实验除不在小室铺胶外，其余步骤同侵袭实验。

1.8 Western blot检测蛋白表达

各组细胞分别培养48 h，蛋白裂解液（强）提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白质浓度。取40 μg/孔蛋白进行10%SDS-PAGE分离，湿转法将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%BSA室温封闭2 h，分别加入适量稀释后抗体E-cadherin（1∶10 000）、Vimentin（1∶1000）、β-actin（内参，1∶10 000），4 ℃摇床合适摇速孵育过夜；吐温与三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBST）洗涤3次，分别加入相应二抗山羊抗兔（1∶5000）、山羊抗小鼠（1∶5000），室温摇床合适摇速孵育1 h，TBST洗涤3次，加入适量增强化学发光法（ECL）发光试剂，暗室内曝光显影，图像分析。

1.9 qRT-PCR检测上皮间质转换相关蛋白E-cadherin和Vimentin基因表达

各组细胞分别培养48 h，酚-氯仿法提取各组细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光光度仪测定RNA的完整性，各组样品吸光度比值均在1.8～2.1。按试剂盒说明书进行总RNA反转录实验，反转录条件：37 ℃、30 min；98 ℃、5 min；-20 ℃保存。再以cDNA为模板，与基因特异性引物PCR扩增E-cadherin和Vimentin。扩增后对解离曲线进行分析，确保只有单一产物被扩增。最终进行测定分析。实验重复3次。内参基因为GAPDH，引物序列见表1，引物均由上海生物工程有限公司合成。E-cadherin和Vimentin的mRNA表达以GAPDG作为内参照，ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因，ΔΔCt=ΔCt最低样本-ΔCt其他样本，以2-ΔΔCt值表示。endprint

1.10 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，满足正态分布组间比较用t检验，多组间比较方差齐用方差分析、方差不齐用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健脾消癌方对SW620细胞增殖的影响

与对照组（10%、15%、20%空白血清）比较，健脾消癌方药物血清对SW620细胞体外生长有明显的抑制作用，且呈浓度与时间依赖性。健脾消癌方药物血清处理SW620细胞24 h，15%、20%药物血清对SW620细胞的生长都具有抑制作用，其中15%药物血清浓度处理24 h，对细胞的生长抑制率为18%，处理48 h的生长抑制率达到32%；而20%健脾消癌方药物血清处理24 h，对细胞的生长抑制率为29%，处理48 h后的生长抑制率则达到56%。结果见图1。

2.2 健脾消癌方对SW620细胞迁移能力的影响

与空白组比较，TGF-β1诱导组进入小室膜下SW620细胞明显增多（P<0.05），健脾消癌方能明显减少进入小室膜下方经TGF-β1诱导的SW620细胞（P<0.05），且空白组与TGF-β1+健脾消癌方组比较无明显差异（P>0.05）。结果见图2。

2.3 健脾消癌方对SW620细胞侵袭能力的影响

与空白组比较，TGF-β1诱导组能使穿透小室膜进入其下方的SW620细胞明显增多（P<0.05），而健脾消癌方能明显减少进入小室下方的经TGF-β1诱导的SW620细胞（P<0.05），且空白组与TGF-β1+健脾消癌方组比较无明显差异（P>0.05）。结果见图3。

2.4 健脾消癌方对上皮间质转换相关蛋白E-cadherin和Vimentin mRNA表达的影响

与空白组比较，TGF-β1诱导组细胞上皮标志蛋白E-cadherin mRNA表达明显降低，间质标志蛋白Vimentin mRNA表达明显升高（P<0.05）；与TGF-β1诱导组比较，TGF-β1+健脾消癌方组细胞E-cadherin mRNA表達上调，Vimentin mRNA表达明显降低（P<0.05）。结果见图4。

2.5 健脾消癌方对上皮间质转换相关蛋白E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响

与空白组比较，TGF-β1诱导组细胞上皮标志蛋白E-cadherin蛋白表达明显降低，间质标志蛋白Vimentin蛋白表达明显升高（P<0.05）；与TGF-β1诱导组比较，TGF-β1+健脾消癌方组细胞E-cadherin蛋白表达上调，Vimentin蛋白表达明显降低（P<0.05）。结果见图5。

3 讨论

健脾消癌方是蒋益兰教授根据其多年临床经验总结，以健脾益气、化瘀解毒为法创制的用于治疗结直肠癌复发转移的方剂。我们以往的实验研究表明，健脾消癌方能有效抑制结直肠癌裸鼠的肝转移率，其机制可能是通过抑制金属基质蛋白酶-9的蛋白表达而发挥作用，但对其是否可以调控结肠癌细胞的EMT行为还知之甚少[6]。

研究表明，结直肠上皮细胞发生EMT是结直肠癌生长与转移的重要因素，结直肠癌细胞发生EMT会使自身侵袭性、抗凋亡能力及耐药性增强，有利于肿瘤细胞的局部浸润和远端转移，加快结直肠癌的发展进程[5]。抑制结肠癌细胞EMT发生可作为研发抗结肠癌药物的一个重要方向。赵汝楠等[7]研究发现，蟾毒灵作为抗肿瘤药物华蟾素中的重要生物学活性成分，具有明显的抑制结肠癌细胞生长增殖、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移等作用，其机制可能是通过阻止结肠癌细胞的EMT而发挥其抑制作用。

TGF-β1是TGF-β家族中的重要因子之一，在多种肿瘤的发生和发展中被证实为细胞EMT的重要诱导因子，与肿瘤的增殖、分化、迁移和侵袭密切相关。肿瘤细胞膜上TGF-β受体与TGF-β1因子结合后，可以激活TGF-β受体，使其细胞内靶标蛋白smad2和samd3发生磷酸化，再与smad4蛋白结合，抑制上皮标志蛋白E-cadherin的表达和促进间质标志蛋白Vimentin的表达，最终使上皮细胞极性受到破坏，细胞与细胞之间的连接变得松散，从而发生肿瘤细胞的侵袭和迁移[8-10]。本实验结果表明，健脾消癌方能显著抑制结直肠细胞的增殖、迁移和侵袭，并呈明显的剂量依赖性，其作用机制与抑制结肠癌细胞的EMT过程密切相关，我们还发现，健脾消癌方可明显抑制TGF-β1因子所诱导的EMT，显著诱导上皮标志蛋白E-cadherin的表达，下调Vimentin的表达，维持细胞间紧密的连接，从而防止肿瘤细胞发生迁移和转移，其具体分子机制有待进一步研究。

参考文献：

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