健脾活血方对SMMC—7721肝癌裸鼠抑瘤作用的研究

董孟佳+许尤琪+沈明勤

摘要：目的 观察健脾活血方对肝癌裸鼠皮下移植瘤模型细胞凋亡和血管生成的影响，探讨其可能的作用机制。方法 建立SMMC-7721肝癌荷瘤裸鼠模型。将60只雄性荷瘤裸鼠随机分为空白组、模型组、5-Fu组和健脾活血方高、中、低剂量组，每组10只。健脾活血方各剂量组给予相应浓度健脾活血方药液灌胃，每日1次，5-Fu组给予5-Fu隔日腹腔注射，连续2周。2周后比较各组裸鼠体质量、瘤质量和抑瘤率，免疫组化检测血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体2（VEGFR-2）的蛋白表达，计算微血管密度（MVD），qRT-PCR检测Caspase-3和生存素（Survivin）的mRNA表达。结果 与模型组比较，各给药组VEGF、VEGFR-2蛋白表达，MVD和Caspase-3、Survivin mRNA表达均降低，其中5-Fu组和健脾活血方高剂量组作用最明显（P<0.05）。结论 健脾活血方可能通过抑制血管生成和诱导细胞凋亡作用抑制肿瘤生长。

关键词：健脾活血方；肝癌；血管生成；细胞凋亡；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.009

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0038-04

Study of Anti-tumor Effect of Jianpi Huoxue Prescription on SMMC-7721 Hepatoma Mice DONG Meng-jia1， XU You-qi2， SHEN Ming-qin3

1. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. NO.2 Hospital of TCM of Jiangsu Province， Nanjing 210023， China；

3. Jiangsu Province Institute of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China

Abstract： Objective To observe the effects of Jianpi Huoxue Prescription on the subcutaneous transplantation of tumor cell apoptosis and angiogenesis； To discuss its possible mechanism of action. Methods SMMC-7721 hepatoma mice models were established. 60 tumor bearing male mice were randomly divided into blank group， model group， 5-Fu group， Jianpi Huoxue Prescription high-， medium- and low-dosage groups， with 10 rats in each group. Model group and Jianpi Huoxue Prescription high-， medium- and low-dosage groups were given medicine with relevant concentrations for gavage， once a day. 5-Fu group was given 5-Fu for intraperitoneal injection every other day. The weight， tumor weight and tumor inhibitory rate of each group were compared two weeks later. The protein expressions of VEGF and VEGFR-2 were detected by immunohistochemistry， microvessel density （MVD） were calculated， and the expressions of Survivin and Caspase-3 mRNA were detected by RT-qPCR. Results Compared with model group， protein expressions of VEGF and VEGFR-2， MVD， Caspase-3 and Survivin mRNA decreased in Jianpi Huoxue Prescription high-， medium- and low-dosage groups， and the most obvious differences were in 5-Fu group and Jianpi Huoxue Prescription high-dosage group （P<0.05）. Conclusion Jianpi Huoxue Prescription can inhibit tumor growth by inhibiting angiogenesis and inducing apoptosis.

Keywords： Jianpi Huoxue Prescription； hepatoma； angiogenesis； apoptosis； mice

健脾活血方臨床用于治疗肝癌，具有抑制肿瘤生长、提高生存质量和对化疗减毒增效的作用[1]。本实验观察健脾活血方对肝癌裸鼠皮下移植瘤模型肝癌细胞凋亡和血管生成的影响，探讨其可能的作用机制，为临床应用提供依据。endprint

1 实验材料

1.1 细胞株和动物

SMMC-7721人肝癌细胞株，南京凯基生物科技发展有限公司；SPF级BALB/c（nu/nu）裸鼠60只，雄性，5～7周龄，体质量18～20 g，南京沐途医疗科技有限公司，动物许可证号SYXK（苏）2016-0010，饲养于南京中医药大学SPF级动物实验室。

1.2 药物及制备

健脾活血方（黄芪30 g，太子参30 g，茯苓10 g，白术10 g，山药10 g，茵陈15 g，薏苡仁30 g，莪术15 g，石打穿15 g，半枝莲15 g），南京中医药大学附属第二医院制剂中心制备，饮片浸泡2 h，煮沸后改文火煎煮15 min，纱布过滤取汁，药渣加水再次煎煮30 min，2次药汁混合，再浓缩并定容；氟尿嘧啶注射液（5-Fu），上海旭东海普药业有限公司，批号1512161。根据人用药剂量结合转换公式计算裸鼠的用药量[2]。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM不完全高糖培养液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Trysin）、磷酸盐缓冲液（PBS），江苏凯基生物技术股份有限公司；组织黏合剂（德国BRAUN公司），超净工作台（SW-CJ-1FD，苏州市苏杭科技器材有限公司），CO2培养箱（美国Thermo公司），离心机（德国Heraeus公司），水浴锅（GKC，通州市沪通实验仪器厂），电子天平（Saitorius BS400S，南京天平科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模

取对数生长期生长良好SMMC-7721肝癌细胞株，胰酶消化，制成单细胞悬液，浓度为2×107个/mL，将肿瘤细胞接种于4只BALB/c（nu/nu）裸鼠右侧近腋窝皮下，每只0.2 mL。当腋下移植瘤长至直径约10 mm时，无菌操作剥取移植瘤，剔除纤维包膜，将生长良好、呈淡红色、鱼肉样的瘤组织剪切成直径约2 mm×1 mm的小块，匀浆后制成细胞悬液，浓度约为3×107/mL，再将肿瘤细胞接种于50只BALB/c（nu/nu）裸鼠右侧近腋窝皮下，每只0.2 mL。

2.2 分组和给药

接种成功后，将50只裸鼠随机分为模型组、5-Fu组和健脾活血方高（73.8 g/kg）、中（36.9 g/kg）、低（18.4 g/kg）剂量组（简称中药高、中、低剂量组），每组10只，于模型建立72 h后开始给药。中药高、中、低剂量组给药浓度为7.4、3.7、1.85 g/mL，模型组予等量生理盐水灌胃，给药体积0.2 mL，每日1次，连续2周；5-Fu组予5-Fu，以生理盐水稀释成6 mg/mL，每次0.2 mL腹腔注射，隔日1次，连续2周。另以10只未接种的裸鼠作为空白组，正常饮食。

2.3 抑瘤率检测

给药第14日裸鼠禁食不禁水，第15日称重并记录。脱颈处死裸鼠，钝性剥离移植瘤，生理盐水清洗干净，滤纸吸干，称重并记录，计算抑瘤率（1-给药组平均瘤质量÷模型组平均瘤质量×100%）。

2.4 血管内皮生长因子及其受体2蛋白表达测定

肿瘤组织制作蜡块切片，按免疫组化染色试剂盒说明进行操作，DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。结果判定：蛋白阳性染色均为胞浆，包膜出现棕黄色及棕褐色均匀颗粒，应用计算机MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统对血管内皮生長因子（VEGF）和VEGF受体2（VEGFR-2）的免疫组化染色灰度值进行定量分析和测量。

2.5 微血管密度计数

参考文献[3]方法。CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准；微血管技术以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数。只要结构部相连，其分支结构也计做1个血管计数，只要结构不相连，其分支结构也计做1个血管计数。低倍镜下（×100）观察切片。选择微血管分布最高密度区，然后高倍镜下（×200）计数3个视野的微血管数。取其平均值为微血管密度（MVD）值[4]。

2.6 Caspase-3和Survivin mRNA表达检测

抽取总RNA，按Trizol说明书进行并定量，加入1 mL总RNA提取试剂Trizol，充分混匀后用0.2 mL氯仿抽取，等体积异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤RNA，空气干燥，加20 ?L无RNA酶水溶解。按反转录试剂盒说明书步骤将RNA反转录为cDNA。实时荧光定量PCR反应体系总体积为20 ?L，含SYBR green燃料10 ?L（2×），Caspase-3、Survivin序列引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。每个基因做3个复孔。PCR扩增条件：95 ℃、10 s 1个循环，95 ℃、5 s和60 ℃、20 s 45个循环。融解曲线反应条件为：95 ℃、10 s，以0.1 ℃/s速度上升至95 ℃，排除非特异性扩增。依此检测Caspase-3和Survivinm RNA的表达，基因表达相对定量分析采用2-ΔΔCt法。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

实验过程中因灌胃过程损伤胃和食管、操作过程中注射感染以及自身肿瘤消耗致部分裸鼠死亡，其中中药低剂量组给药第4、7日各死亡1只，中药中剂量组给药第7、8、11日各死亡1只，5-Fu组给药第11、13日各死亡1只。给药第12日，模型组裸鼠出现生命衰竭症状，周身消瘦，弓背状，肋骨可见，遂于第14日脱颈处死动物。

4.2 健脾活血方对裸鼠皮下移植瘤质量的影响

与模型组比较，空白组和中药中、高剂量组裸鼠给药后体质量增加（P<0.05）；与模型组比较，中药高剂量组和5-Fu组瘤质量明显降低（P<0.05），其抑廇作用明显。结果见表1。endprint

4.3 健脾活血方对裸鼠瘤组织血管内皮生长因子及其受体2蛋白表达的影响

与模型组比较，各给药组VEGF及VEGFR-2蛋白表达均降低，其中5-Fu组和中药高剂量组作用最明显（P<0.05）。结果见表2。

4.4 健脾活血方对裸鼠瘤组织微血管密度的影响

与模型组比较，各给药组MVD均降低，其中5-Fu组和中药高剂量组降低最明显（P<0.05）。结果见表3。

4.5 健脾活血方对裸鼠瘤组织Caspase-3、Survivin mRNA表达的影响

与模型组比较，各给药组Caspase-3和Survivin mRNA表达均升高，其中5-Fu组和中药高剂量组作用最明显（P<0.05）。结果见表4。

5 讨论

本研究建立裸鼠肝癌SMMC-7721细胞实体瘤移植模型，考察了健脾活血方对裸鼠体质量及瘤质量的影响。其中5-Fu组裸鼠平均体质量明显低于其他各组裸鼠，推测其原因可能是5-Fu为抗代谢类抗肿瘤药，并且可引起消化道不适的症状，影响裸鼠进食状态。从各给药组抑瘤率来看，中药高剂量组与5-Fu组相近，显示健脾活血方对肝癌裸鼠具有一定的增加体质量和抑制肿瘤生长的作用。

肝脏为双重血供的器官，肝癌细胞的增殖与转移都与血管生成关系密切，VEGF是抗肝癌血管生成药物治疗的重要靶点[5]。VEGF信号通路是调控新生血管的关键信号通路，VEGF及其受体是较强的促血管生成因子，被认为与诱导肿瘤微血管生成密切相关[6]。同时，实验选用反映肿瘤血管生成情况最理想的MVD作为指标，结果显示，健脾活血方对肝癌MVD、VEGF和VEGFR-2具有明显的下调作用，并与药物浓度呈正相关，表明健脾活血方可能通过作用于VEGF和VEGFR-2这2个靶点，实现控制血管生成，达到抑制肿瘤生长的目的。

Surivivin作为凋亡抑制基因，定位于人染色体17q25，处于细胞凋亡途径的中心地位，研究发现其致病机制可能是调节PI3K/AKT通路，并通过直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性来抑制细胞凋亡[7]。同时可以上调VEGF的表达，参与肿瘤血管形成，在肝癌的发生、发展中起重要作用[8-9]。Caspase是细胞凋亡过程中期重要作用的蛋白酶家族，Caspase-3是其中关键的蛋白酶，所介导的蛋白剪切是细胞凋亡机制的最重要部分之一。相关实验显示，Caspase-3和Survivin可能共同参与肝细胞增殖及转化细胞凋亡过程的调节，并且二者表达呈负相关[10]。实时荧光定量PCR检测结果显示，健脾活血方可显著降低肝癌细胞SMMC-7721凋亡抑制基因Surivivin，提高Caspase-3 mRNA的表达，这可能是健脾活血方诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长的主要机制之一。

综上所述，本实验结果显示，健脾活血方可能通过诱导细胞凋亡和抗血管生成实现抗肿瘤作用，为健脾活血方在临床的应用提供了一定的实验依据。

参考文献：

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