外周血及胸腔积液γ-干扰素释放试验对结核性胸膜炎的诊断价值

周敏，杨清銮，陈华昕，于志明，高亮，刘倩倩，欧勤芳

结核性胸膜炎作为第二常见的肺外结核表现[1-2]，常因临床表现不典型，难以与其他疾病鉴别而延误诊断。目前，在胸腔积液中找到结核杆菌是确诊结核性胸膜炎的金标准，但通常获取的胸腔积液由于量少、含菌量不高，而导致结核杆菌培养假阴性率较高[3-4]。其他传统的辅助检查方法如胸腔积液的常规及生化检查等均缺乏足够的敏感度与特异度[5]。尽管临床上也可通过胸膜活检等有创性检查来辅助诊断[6]，但有创性检查往往会增加并发症发生的可能[7]。因此，临床需要一个快速，且敏感度、特异度高的试验来辅助结核性胸膜炎的诊断。近年来，外周血γ-干扰素释(IFN-γ)放试验被越来越多的人认可，其对结核病的诊断有很大的辅助价值[8]。T-SPOT.TB作为一种IFN-γ释放试验，以体外酶联反应斑点试验为基础，通过检测经早期分泌性抗原靶-6(early secretary antigenic target6，ESAT-6)、培养滤液蛋白-10(culture filtrate protein10，CFP-10)抗原刺激后释放的IFN-γ T细胞数，从而判断受试者是否感染结核[9]。本研究初步探讨外周血及胸腔积液者T-SPOT.TB诊断结核性胸膜炎的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2014年1－12月上海市华山医院感染科及2015年6月－2016年6月无锡市第五人民医院肺科住院的胸腔积液患者56例，均签署知情同意书。病例均由专人随访并核实诊断。结核性胸膜炎患者入选标准：①胸腔积液或痰培养结核分枝杆菌阳性(确诊结核性胸膜炎患者)；②胸腔积液为渗出液，普通细菌培养阴性，结核分枝杆菌培养阴性同时不合并其他脏器结核，符合结核性胸腔积液的临床表现如低热、盗汗、乏力、胸闷等，且抗结核治疗有效者(临床诊断结核性胸膜炎患者)。非结核性胸膜炎患者入选标准：胸腔积液为渗出液，结核分枝杆菌培养阴性，且抗结核治疗无效，随访1～3个月，无结核症状。排除年龄＜18岁，病史不完整，诊断不明确，或未完成随访的患者。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 应用肝素抗凝管采集上述患者外周静脉血5ml，应用无菌离心管采集新鲜胸腔积液50ml。

1.2.2 外周血及胸腔积液IFN-γ释放试验 采用T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec，Abingdon，UK)检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)Mtb基因组差异区1(region of difference，RD1)编码的抗原特异性T细胞应答，试剂盒由对患者临床特征不知情的实验室人员于样品收集后6h内进行。T-SPOT.TB以ESAT-6(6 000kD)和CFP-10(10 000kD)作为特异性抗原。通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)和胸腔积液单核细胞(pleural effusion mononuclear cells，PE-MCs)；将获得的PBMCs和PE-MCs铺在用抗γ-干扰素抗体预先包被的平板上(每孔2.5×105个)，平板置于37℃、5%CO2中，孵育16～18h后加入显色剂避光显色；采用自动化ELISPOT读数器计数斑点形成细胞(spots forming cells，SFC)。当抗原包含6个或以上斑点且斑点数目为阴性对照孔的2倍时记为阳性。PBMCs和PEMCs阴性对照孔的斑点背景数量应分别小于10个和20个。

1.2.3 评价指标 以临床最终诊断结果为标准，评价外周血及胸腔积液T-SPOT.TB的敏感度、特异度、预测值、似然比等。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。对年龄等连续变量采用Mann-Whiney检验法，对两组阳性检出率等分类变量采用确切概率法(Fisher's test)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 共入选胸腔积液患者56例，分为结核性胸腔积液组和非结核性胸腔积液组，其中结核性胸腔积液组38例，男31例，平均年龄51.0(30～72)岁；4例为确诊患者，34例为临床诊断患者，抗结核治疗均有效。非结核性胸腔积液组18例，男12例，平均年龄66.9(55～77)岁，包括恶性胸水15例(83.3%)，确诊为结核分枝杆菌外的其他细菌感染性胸腔积液3例(16.7%)。恶性胸水患者均经病理细胞学证实。两组外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血红蛋白、血小板、血沉，胸腔积液的蛋白数、乳酸脱氢酶等差异均无统计学意义(P＞0.05)，但胸腔积液的单个核细胞数(P=0.03)和腺苷脱氨酶(P＜0.01)之间差异有统计学意义(表1)。

2.2 外周血与胸腔积液T-SPOT.TB检测结果 结核性胸腔积液组38例患者中，37例患者行血T-SPOT.TB试验，其中阳性32例，阳性率86.5%；37例患者行胸腔积液T-SPOT.TB试验，全为阳性，阳性率100%。非结核性胸腔积液组18例患者中，17例患者行血T-SPOT.TB试验，其中阳性8例，阳性率47.1%；17例患者行胸腔积液T-SPOT.TB试验，11例阳性，阳性率64.7%。两组之间外周血和胸腔积液的T-SPOT.TB检测结果差异有统计学意义(P＜0.05，表1)。

两组外周血和胸腔积液T-SPOT.TB对ESAT-6和CFP-10的反应如图1所示。以目前较为公认的6SFC/2.5×105个细胞数为区分阴性和阳性的临界值，两组外周血与胸腔积液的T-SPOT.TB试验敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.5%(95%CI 71.2%～95.5%)和100%(95%CI 90.5%～100%)，52.9%(95%CI 27.8%～77.0%)和35.3%(95%CI 14.2%～61.7%)，80.0%(95%CI 64.4%～90.9%)和77.1%(95%CI 62.7%～88.0%)，64.3%(95%CI 35.1%～87.2%)和100%(95%CI54.1%～100%，表2)，提示外周血及胸腔积液T-SPOT.TB对结核性胸膜炎的诊断有很高的敏感性，但特异性较低。

表1 56例疑似结核性胸膜炎患者的血及胸腔积液指标比较Tab.1 Comparison of various diagnostic index in 56 patients with suspected tuberculous pleurisy

图1 结核性与非结核性胸膜炎患者外周血和胸腔积液对IFN-γ释放试验中ESAT-6和CFP-10的反应Fig.1 Box-and-whisker plot showing responses to ESAT-6 and CFP-10 according to the PBMC and PE-MC T-SPOY.TB

2.3 ROC曲线预测外周血及胸腔积液T-SPOT.TB检测的诊断价值 采用ROC曲线估计58例患者外周血及胸腔积液T-SPOT.TB的诊断价值，胸腔积液T-SPOT.TB的ROC曲线下面积(AUC)为0.9459(95%CI 0.891～1.000，P＜0.001)，高于外周血T-SPOT.TB的AUC(0.7663，95%CI 0.666～0.860，P＜0.001，图2)。基于ROC曲线的分析，胸腔积液T-SPOT.TB诊断结核性胸膜炎的临界值为47SFC/2.5×105个细胞，敏感度为89.2%，特异度为88.2%，阳性预测值为94.3%，阴性预测值为78.9%，阳性似然比达7.58，阴性似然比为0.123。当联合外周血和胸腔积液T-SPOT.TB时，并联两个试验可以提高敏感度至97.4%，提高阴性预测值至90.9%，阴性似然比降至0.047；而串联两个试验未能明显提高诊断效能(表2)。

表2 外周血和胸腔积液T-SPOT.TB的独立和联合诊断价值(%)Tab.2 Diagnostic performance of PBMC and PE-MC T-SPOT.TB in the study population (%)

图2 外周血和胸腔积液T-SPOT.TB诊断结核病的ROC曲线Fig.2 ROC curves in PBMCs and PE-MCs T-SPOT.TB for diagnosis of tuberculous pleurisy

3 讨 论

本研究初步探索外周血及胸腔积液T-SPOT.TB的诊断价值，并尝试寻找胸腔积液T-SPOT.TB诊断结核性胸膜炎的临界值。

本研究发现，对结核性胸膜炎患者而言，胸腔积液T-SPOT.TB的斑点数普遍高于外周血，因此仍然以目前试剂盒推荐的6SFC/2.5×105个细胞为临界值不一定合适。根据IFN-γ释放试验检测原理，可知该检测的敏感度与检测标本中Mtb特异性T淋巴细胞的数量和反应能力存在相关性。在活动性结核感染中，特异性T淋巴细胞增殖并募集至感染部位，因此结核病灶局部特异性T淋巴细胞的分布密度要高于外周血。Souza等[10]在小鼠模型中发现了T淋巴细胞在胸膜腔中的聚集，而在结核性胸膜炎患者中，Barnes等[11]也发现胸水比外周血存在更多的CD4+T细胞，并且胸水中T细胞分泌的IFN-γ高于血中分泌的IFN-γ，这可解释本研究胸腔积液T-SPOT.TB点数较外周血T-SPOT.TB多的结果。我们的前期研究发现，外周血IFN-γ释放试验诊断结核性胸膜炎的敏感度为93%[12]，而本研究进一步证实，当胸腔积液与外周血均以6SFC/2.5×105个细胞作为临界值时，胸腔积液T-SPOT.TB的敏感度大于血T-SPOT.TB的敏感度。

在我们的研究中，若胸腔积液以47SFC/2.5×105个细胞作为临界值，与外周血相比，敏感度从86.5%提高到89.2%，特异度从52.9%提高到88.2%，阳性预测值从80.0%提高到94.3%，阴性预测值从64.3%提高到78.9%，阳性似然比1.84提高到7.58，阴性似然比从0.255降低至0.123。但是，当胸腔积液T-SPOT.TB仍以6SFC/2.5×105个细胞为临界值时，仅在敏感度、阴性预测值上较血T-SPOT.TB高。与本研究不同的是，刘晓清等[9]在北京协和医院的一项187例患者的队列研究中，得出当浆膜腔积液T-SPOT.TB与外周血T-SPOT.TB均以6SFC/2.5×105个细胞为临界值时，在敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值方面已有提高。考虑结论不同的原因一方面为本研究病例数较少，另一方面对照组多为肿瘤患者，可能存在免疫功能异常情况，影响T-SPOT.TB的检验效能。

本研究ROC曲线分析结果发现，胸腔积液T-SPOT.TB的AUC为0.9459，大于外周血T-SPOT.TB(0.7663)；并且当胸腔积液T-SPOT.TB临界值取47SFC/2.5×105个细胞时，胸腔积液T-SPOT.TB的敏感度为89.2%，特异度为88.2%。Zhang等[13]在北京胸科医院的一项98例患者的队列研究中，得出胸腔积液T-SPOT.TB的特异度(94.5%)远远高于外周血(76.1%)，且推荐临界值为54 SFC/2.5×105个细胞。本研究结论进一步增加了该结果的可信度。

本研究存在一定的缺陷，即研究样本数较少，且多为临床诊断，仅有4例患者有细菌学依据。因结核性胸膜炎细菌学诊断的假阴性率很高，难以实现研究样本均为确诊病例，但我们入选了临床高度诊断的结核性胸膜炎以规避夸大T-SPOT.TB的诊断价值。

综上所述，相比于外周血IFN-γ释放试验T-SPOT.TB而言，胸腔积液T-SPOT.TB可能对结核性胸膜炎有更高的诊断价值，且47SFC/2.5×105个细胞可能作为区分结核和非结核性胸膜炎的参考临界值。胸腔积液T-SPOT.TB的诊断价值仍需要进一步经过大样本研究进行验证，以期得出更为可靠的循证医学证据。

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