HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗体MAIPA定量检测方法的建立

李睿书， 凌 冰， 陆 萍

（上海市血液中心 上海市输血研究所，上海 200051）

作为国际输血学会（the International Society of Blood Transfusion，ISBT）推荐的检测人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗体的金标准，单克隆抗体特异性免疫固定检测（monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen，MAIPA）法具有很高的敏感性和特异性，其重要特点之一是血小板（platelet，PLT）表面抗原在与血清中的抗体、特定抗人PLT膜糖蛋白单抗结合的过程中，仍然保持着天然的构象。另外，MAIPA还可用于PLT的分型。然而，国内虽然有使用MAIPA进行PLT抗体检测的临床应用[1-3]，但成熟稳定的MAIPA定量检测方法尚未建立。在引发新生儿同种免疫性血小板减少症的HPA抗体中，HPA-1a、HPA-5b和HPA-3a的抗体相对较为常见[4-5]。为此，本研究初步建立了针对HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b抗体的MAIPA定量检测方法。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

采用G&T SSP Typer基因分型试剂盒（美国G&T Biotech公司，批号W9902、B9811A）对重复献血者进行人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和HPA基因分型，建立上海市单采PLT供者资料库。O型HPA-1a/a、HPA-3a/a、HPA-5a/b的新鲜单采PLT来自资料库筛选的特定血型的献血者，采集于上海市血液中心。HPA-1a标准抗血清、HPA-3a参比抗血清、HPA-5b参比抗血清购自英国国家生物制品检定所，货号分别为03/152、03/190、99/666；小鼠抗人CD61单克隆抗体购自美国BD公司，货号为555752；小鼠抗人CD41和CD49b单克隆抗体购自美国R&D公司，货号分别为MAB7616和MAB1233；羊抗鼠IgG单抗、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗人IgG均购自美国Jackson公司，货号分别是115-005-071、109-035-098；包板液、HRP底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺和终止液均购自美国SurModics公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 酶标板包被 用包被液稀释羊抗鼠IgG至3 μg/mL，平底酶标板每孔加入100 μL，4 ℃静置过夜，Tris盐缓冲液（Tris 1.21 g、NaCl 8.5 g、CaCl20.055 g、NP40 5 mL、Tween 0.5 mL，定容至1 L）洗涤3次并浸泡30 min封闭。

1.2.2 PLT准备 单采PLT用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）/乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA；含EDTA- Na23.35 g、Na2HPO4·12H2O 7.52 g、NaCl 8.18 g，pH值调至7.0，定容至1 L）溶液洗涤，1 455×g离心 5 min，弃上清，重复2次。PLT洗涤完毕后重新悬浮于PBS/EDTA中，用血液分析仪将终浓度调整至200×109/L。

1.2.3 MAIPA定量检测方法的建立 在U形底微孔板中每孔加入100 μL PLT悬液，1 455×g离心3 min，弃上清，在吸水纸上轻轻拍干。根据实验设计，在各孔中分别加入标准抗血清或待测血清样品50 μL，将PLT轻轻吹打均匀，37 ℃孵育30 min。用PBS/EDTA洗涤2次，每次1 455×g离心3 min，弃上清，在吸水纸上轻轻拍干。各孔加入合适浓度的鼠抗人相应PLT糖膜蛋白单抗40 μL（稀释液为0.1%牛血清白蛋白-PBS），将PLT轻轻吹打均匀，37 ℃孵育30 min。用PBS/EDTA洗涤3次，每次1 455×g离心3 min，弃上清，在吸水纸上轻轻拍干。每孔加入130 μL裂解液（Tris 0.6 g、NaCl 4.25 g、NP40 2.5 mL，pH值调至7.4，定容至0.5 L），将PLT吹打悬浮，室温裂解15 min。4 ℃ 3 724×g离心15 min，每孔吸取上清100 μL至封闭好的平底酶标板中，4 ℃反应2 h。TBS洗涤液洗涤3次，每孔加入合适浓度的HRP标记的羊抗人IgG（稀释液为0.1%牛血清白蛋白-PBS），37 ℃孵育30 min。TBS洗涤液洗涤3次，每孔加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺，室温显色30 min，加入终止液终止反应，在酶标仪450 nm波长处检测吸光度（A）值。

1.2.4 方法学评价 （1）标准曲线：HPA-1a标准抗血清（03/152）的原始浓度为100 UI，HPA-3a抗血清（03/190）和HPA-5b抗血清（99/666）的原始浓度均为100 AU，分别配制不同浓度的HPA-1a抗血清（0、1、2、3、4 IU）、HPA-3a抗血清（0、1、2、4、8、12、16、20 AU）和HPA-5b抗血清（0、2、4、8、12、16、20 AU），绘制标准曲线，并进行线性拟合。（2）敏感性试验：分别对上述3种抗血清零标准品测定20次，以检测值的x +3s作为方法的敏感性，计算方法为将算得的x +3s值代入标准曲线，得到的相应抗体浓度即为敏感性。（3）特异性试验：用3种抗体的MAIPA定量检测法分别对以上3份抗血清（03/152、03/190、99/666）和人源抗体抗A、抗B、抗I、抗P（滴度＞1∶64，10倍稀释）进行测定，根据方法的敏感性判断其阴、阳性。（4）准确性和精密度试验：针对方法检测HPA-1、HPA-3a、HPA-5b抗体的MAIPA方法，分别选择对应的标准抗血清或参比抗血清线性范围内的3个不同浓度，批内测定12次，批间测定7次，分别计算其平均回收率和变异系数（coefficient of variation，CV）。

表1 HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b抗体MAIPA定量检测标准体系经优化后的实验条件

2 结果

HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b抗体MAIPA定量检测标准体系经过优化的实验条件见表1。

2.1 标准曲线

HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b 3种抗体的MAIPA定量检测方法的检测范围分别为0～4 IU、0～20 AU、0～20 AU，标准曲线在检测范围内具有良好的线性拟合度（R2＞ 0.99）。见图1。

2.2 敏感性

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的MAIPA定量检测方法的敏感性分别为0.3 IU、1.0 AU和1.5 AU。见表2。

2.3 特异性

图1 HPA-1a、 HPA-3a和HPA-5b 3种抗体MAIPA定量检测方法的标准曲线

表2 HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体MAIPA定量检测方法的敏感性

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的MAIPA定量检测方法检测不同HPA抗血清（03/152、03/190、99/666）均为阳性，而检测人源抗体抗A、抗B、抗I、抗P均无明显阳性。方法具有良好的特异性。见图2。

2.4 准确性和精密度

图2 MAIPA定量检测方法的特异性

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的MAIPA定量检测方法的准确性（回收率）为96.20%～103.10%、97.90%～103.10%、100.20%～106.10%，批内精密度（CV）分别为1.3%～3.6%、2.7%～5.2%和4.7%～5.3%，批间精密度（CV）分别为4.0%～5.6%、4.4%～5.9%和3.2%～6.3%。见表3。

表3 HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体MAIPA定量检测方法的准确性和精密性

3 讨论

人类PLT抗原是分布在PLT膜糖蛋白上的一类具有型特异性的抗原，在临床上具有特定意义。在输血或妊娠过程中，由于HPA血型不合而产生的同种抗体可引发多种同种免疫疾病。在临床输注PLT时，如果患者血清中检测出PLT抗体，则应该针对抗体的特异性，采用相应抗原阴性的供体PLT进行输注，否则可能引起严重的输血反应。

目前，HPA抗体检测的方法较多，各有优缺点。MAIPA作为ISBT推荐的检测HPA抗体的金标准，在众多方法中有着特殊的地位。MAIPA最大的优点是能检测出HPA抗体的特异性，因为PLT糖蛋白与待测血清以及对应鼠源单抗反应时能保持天然构象，其抗原性没有受到任何破坏。因此，MAIPA也成为ISBT PLT免疫学研讨会质控项目的指定检测方法。尽管已经成为金标准，国外也有一些对于MAIPA实验方法建立和改良的报道[6-10]，并且将其应用于免疫性PLT减少症的临床分析和诊断[11-16]。然而，成熟稳定的MAIPA标准定量检测方法尚未形成。

在建立本方法的实验过程中，本研究对多个步骤的反应条件进行了调整和优化，通过单因素变量分析，同时将实验成本作为考虑因素之一，确定了各步骤的最优条件。预试验结果显示，当HPA-1a标准抗血清浓度超过4 IU时，A450nm值随抗体浓度升高而增加的趋势趋于缓慢，并且逐渐接近平台，因此本研究认为其最佳检测范围是0～4 IU。对于HPA-3a和HPA-5b抗体，当参比抗血清超过20 AU时，A450nm值达到较高水平（＞2.0），但仍然有升高的趋势。考虑到实际运用时，若待测样品的测量值过高，会将其稀释到一个合适的值，因此从节约成本的角度考虑，本研究并没有去尝试寻找其检测范围的上限值。从图2可以看出，用本研究建立的MAIPA定量检测方法检测HPA-3a、HPA-5b抗体时，根据表2中的敏感性判断，HPA-1a抗血清（03/152）检测呈弱阳性，这可能是因为高浓度（10 IU）的HPA-1a抗体造成了非特异吸附。但在实际应用中，如果未知样本中有如此高浓度的HPA-1a抗体，则在HPA-1a抗体的MAIPA定量检测方法中会显示极强的阳性而被检出；在采用MAIPA定量检测方法检测HPA-3a和HPA-5b抗体时，如仅显示弱阳性，则可以认为该样本无HPA-3a、HPA-5b抗体，即使有少量该抗体，与高浓度的HPA-1a抗体相比其临床意义也可基本忽略。因此该现象并不影响本研究建立的MAIPA定量检测方法的临床应用。起初实验时，HPA-3a和HPA-5b抗体检测体系显色普遍很低，为了提高敏感性，我们尝试改变了多种条件。预实验结果显示，改变待测血清与PLT反应的时间和温度以及反应体系的离子强度对实验结果的影响很小。改变反应体系的pH值或加入少量聚乙二醇，可以微弱地增加反应强度。而提高二抗浓度，尤其是HPA-3a和HPA-5b抗体检测体系，可以大大增强反应强度，提高敏感性。

本研究还得到了一些经验性的结论，如：提高PLT浓度对实验的敏感性并无显著的改善作用；酶免疫实验中，封闭通常使用含一定浓度蛋白的试剂，而本研究中的封闭液是否含有蛋白成分却对结果影响不大；HPA-1a抗原在PLT上数量较多，也较为稳定，正常状态下保存2周以上仍可以保持完整的抗原性，实验效果依然较好，而HPA-3a和HPA-5b抗原表达量相对较低，所以反应强度也相应较弱，只能通过提高二抗浓度的方法来提高检测敏感性等。

本研究结果还显示，影响MAIPA检测结果的因素众多，使用不同的单克隆抗体或不同保存方式的PLT等，得到的结果都不尽相同[17]。因此，虽然国内早有利用MAIPA进行临床诊断的报道，但其仅用于定性分析，并没有建立稳定的检测体系并得到定量的检测结果[2-3]。本研究将MAIPIA方法中的各可控因素确定下来，获得了准确性和稳定性均较好的MAIPA定量检测方法，同时具有较高的敏感性和特异性，对于PLT输注无效、新生儿同种免疫性PLT减少症等疾病的诊断具有较高的应用价值。

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