广州地区不同检测系统精子浓度和精子活动力参考区间的建立及验证

石汉振， 陈 西， 曾冬玉

（1.广东省中医院检验科，广东 广州 510120；2.中山大学北校区医学检验系，广东 广州 510120；3.越秀区登峰社区卫生服务中心，广东 广州 510120）

男性精液质量是男性生育能力评价、优生优育的重要指标。目前，我国男性精液质量水平尚缺乏客观的、大范围的调查。国内外关于使用不同检测系统或不同检测方法进行精液参考区间调查的相关研究亦较少。黄春妍等[1]的研究结果显示，1985—1995年间国内男性精液质量未见明显变化，而1995—2008年14年间精子密度和精子总数明显降低，可能与我国进入重化工时代引起环境污染有关。近30年来，多数研究认为生育期男性精液质量逐渐下降，但由于多数文献不是大样本随机对照分析，因此该定论尚缺乏说服力[2]，也有少数研究认为精液质量下降证据尚不充分[3]。精液质量研究数据最早可追溯到1970年，已发表的大部分研究是回顾性的，对混杂因素和偏移难以控制，这可能是结果不一致的原因[4]。

2010年出版的《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）[5]［以下简称世界卫生组织（World Health Organization，WHO）手册］中修订的精子活力分级标准、精子形态学的严格标准和较低的正常参考值（4%）逐渐被国内多数男科实验室采用[6]。但WHO手册对精液常规参考区间的设定中并没有涉及来自占世界人口1/5的中国人群的任何临床数据和资料[7]。因此，尽管WHO手册非常重要，但能否适用于中国人群仍需评估[8]。为此，本研究按不同地域人群及检测系统建立精液常规分析主要指标（精子浓度、精子活动力）的参考区间，并验证其是否适用于广州地区的人群，以期为辅助生殖技术实施提供更准确、可靠的精液质量数据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2015年10月—2016年2月广东省中医院145名体检健康男性的精液标本。

1.2 入选及排除标准

145份标本均来自2年内已生育过健康孩子的男性，排除生殖道或泌尿道慢性炎症、遗传性疾病、生殖道器质性疾病和有严重生活不良习惯者。由于精子质量存在地域性和种族间差异，环境因素如有毒物质、杀虫剂、油漆等化学物质暴露可影响精液质量，体质指数和营养状况对精液质量的影响也是不可忽视的，另外吸烟、饮酒、久坐工作等生活方式也可对男性生殖健康造成损害。因此，在选取参考个体时要考虑排除以上的影响因素。

1.3 仪器与试剂

SCA精子质量分析仪（西班牙Microptic公司）、Marker计数板、改良牛鲍计数板、恒温水浴箱、光学显微镜、精子固定液、玻璃染缸、玻片、盖玻片和10 mL塑料试管。

1.4 方法

1.4.1 收集标本 要求受试者禁欲2～7 d，取精室手淫取精，收集1次射精的全部精液于清洁、无毒密闭容器内，置37 ℃水浴箱中，待液化后进行精液分析。

1.4.2 计算机辅助精液分析系统（computer assisted sperm analysis，CASA）操作步骤 将1滴已液化的精液均匀涂抹在洁净玻片上，在显微镜低倍镜下作初步镜检。根据精子浓度估算稀释倍数，用生理盐水将精子浓度调整到（20～50）×106/mL，用加样枪吸取10 μL精液加样到专用计数板上；使用SCA精子质量分析仪检测精子浓度、前向精子总数、总活动率、前向活动率。

1.4.3 Marker计数板操作步骤 将按适当比例稀释后的精液吸取10 μL滴于Marker平盘中心区域，将盖子盖上，于20倍物镜显微镜下找到视野后计数10个方格，计算精子浓度，并使用计数器分类计算精子活动力。

1.4.4 改良牛鲍计数板操作步骤 将计数板用擦镜纸擦净，在中央计数室上加盖专用厚玻片。将稀释后的精液用吸管吸取1滴置于盖玻片边缘，使精液缓缓渗入，室温放置3 min，待精子全部沉降到计数室内后计数16个小方格内的精子数量。每份标本均计数3次，取平均值，按公式计算精子浓度。

1.5 统计学方法

1.5.1 建立参考区间 去除离群值采用Dixon 所提出的1/3规则。D值指一个极端观测值（大的或小的值）和另一个极端观测值（第二大或第二小的值）之间的绝对差值，而R值指所有观测值全距，即最大极值和最小极值差值。如某个观测值D值≥1/3 R值，就应剔除该极值。去除离群值后，随机抽取不少于120例进行分析。采用SPSS 13.0软件进行统计分析，单侧参考区间取95%可信区间[10]。

1.5.2 验证参考区间 从健康体检人群中另抽取20名健康个体（2年内已生育的男性）进行精液常规分析。如20名健康个体中只有不超过2名个体的检测值超出原始参考区间（取95%可信区间），即通过验证［11］。

1.6 质量控制

精液检验质量控制环节应规范受试者采样前准备（包括禁欲时间）和精液采集方法、及时送检、37 ℃温浴避免精子自身破坏溶解、标本收集后及时处理[12]。分析过程中应注意加样、稀释的规范操作，尽量由同一实验人员进行操作，以减少人为误差，同一标本可做2次或多次平行试验，以缩小随机误差。对使用的设备、仪器、试剂、加样枪校准、质控应有标准操作规程。同一标本应选取不同视野重复计数，严格遵循WHO手册上“对一定总数2个重复计数可接收差异”的要求，控制主观因素引起的误差[9]。此外，为保证避免仪器本身带来的误差，需依据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2文件对3种仪器进行正确度评价。收集5份标本（结果尽量分散于检测范围高、中、低点）分别用3种仪器进行精子浓度与活动力检测。以牛鲍计数板为参考系统，比较Marker计数板和CASA的相对偏移，如果相对偏移＞15%，需查找原因，对Marker计数板和CASA进行校准。

2 结果

145名受试者检测结果均呈正态分布，其中有8个离群值，按照要求予以剔除，剩余137个结果用于统计。

CASA、Marker计数板、改良牛鲍计数板检测精子浓度的参考区间分别为≥27.60×106/mL、≥35.40×106/mL、≥31.00×106/mL。CASA、Marker计数板检测精子总活动力的参考区间分别为≥40.90%、≥49.40%，前向活动力的参考区间分别为≥32.20%、≥35.00%。用于验证的20名健康个体的精液常规检测结果均在参考区间内。本研究建立的参考区间见表1。不同检测系统精液常规分析单侧生物参考区间低值及95%可信区间见表2。

表1 不同检测系统精液常规分析结果

表2 不同检测系统精液常规分析参考区间低值及95%可信区间

3 讨论

参考区间是目前临床实验室最常用的解释检验报告的一个“决策支持工具”[13]。临床实验室的检测结果常与参考区间作比较，以判断其有无临床意义。不同地区健康人群的实验室检验结果有显著差异[14]。ICHIHARA等[15]进行的一项随访研究不仅证实了文献[14]的研究结果，还指出了差异的生物学基础。参考区间建立要注意以下问题：（1）生物属性带来参考区间的差异（主要是年龄、性别、民族、居住地域及妊娠等原因引起的差异）[16]；（2）对于同一项目的检测方法可能有多种等[17]。因此，各实验室有必要建立自己的参考区间。简单地引用文献或直接采用厂商给定的参考区间是不可取的。目前，建立适合我国人群检验项目的参考区间具有重要的临床意义和社会价值。通过转移验证已建立的参考区间来确定自己实验室的参考区间，可以避免不必要的重复检测或临床干预，有效提高临床医生评价患者精液质量及生育能力的诊断准确性，且同时为辅助生殖技术提供更准确的实验室诊断。

精子浓度及活动力检测有多种方法，但WHO手册中只有手工方法（改良牛鲍计数板）的参考区间。随着CASA在我国男科实验室中的广泛应用，使用计数池计数精子的男科实验室越来越少。此外，Marker计数板也是常规用于精子浓度计数的工具之一[18-19]。因此，迫切需要建立这2种方法的参考区间。为此，结合地区人群差异，本研究建立了广州地区3种检测系统精液常规分析主要指标的参考区间。

将本研究建立的精液质量参考区间与WHO手册比较，其中精子浓度及精子总数二者差异较大，主要是由本研究纳入病例数不多、方法学差异、检测技术误差等原因引起。精子活动力差异较小，差异可能是由检测技术误差以及CASA将精液中其他杂质错误分类等原因引起。因此，在以后的研究中将通过增大纳入病例数、减少检测技术误差等手段对精液质量参考区间进行修正。按WHO手册要求，精液参考区间纳入试验者要求是其配偶在停止使用避孕措施后12个月内怀孕，但招募这类课题参与者困难很大，因此本研究将妊娠期限定为24个月内。此外，由于目前精液检查仪器或方法缺乏权威性室间质评结果及性能评价方法，因此均可能造成实验结果发生偏差。

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