自身免疫性疾病患者及健康体检者自身抗体相关实验室指标分析

陈水绵， 俞翀曌， 李恩灵， 朱昊明， 陆靖波， 郑 冰

（上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127）

自身抗体在自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）的诊断与鉴别诊断、病情监测、疗效观察及发病机制研究等方面有重要作用。抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）是抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称，以IgG型为主。随着分子免疫学的发展，抗可提取核抗原（extractable nuclear antigen，ENA）的检测也已应用于多种AID的诊断[1-2]。对AID的深入研究发现，一些AID如类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等有一定的“潜伏期”[3]，在健康人群中也有一定的阳性率，故而对AID患者与健康人群进行区分对临床诊断非常重要。本研究通过大样本分析AID确诊患者血清ANA、ENA、抗双链DNA（ds-DNA）抗体等自身抗体水平，以探讨ANA相关实验室检测结果对临床的指导作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取上海交通大学医学院附属仁济医院2016年3—9月就诊、符合美国风湿病学会及肝病学会诊断标准的SLE患者1 001例、RA患者408例、干燥综合征（Sjögren syndrome，SS）患者255例、炎症性肌病（inflammatory myositis，IM）患者54例、原发性系统性硬皮病（primary systemic sclerosis，PSS）患者40例、强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者36例、混合型结缔组织病（mixed connective tissue disease，MCTD）患者17例、原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者57例、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）患者37例，共1 905例患者，设为AID组；4 433名健康体检者来自上海交通大学医学院附属仁济医院体检中心，被检测人群无现有临床症状、无严重疾病史（如癌症、传染病、糖尿病等）、排除孕期妇女。AID组年龄（42.2±16.3）岁，男254例、女1 651例；健康体检组年龄（48.3±11.0）岁，男2 444名、女1 989名。

1.2 方法

ANA采用INOVA间接免疫荧光法检测试剂盒在Quanta lyser 240免疫分析系统（西班牙BIOKIT.S.A公司）及INOVA View全自动免疫荧光显微镜上检测，滴度≥1∶40判为阳性。ENA采用免疫斑点法试剂盒（德国Euroimmun公司）在BlotOne免疫印迹仪（德国Euro公司）上检测，包被的特异性抗体有抗Sm抗体、抗尿嘧啶1低分子量核糖核蛋白（uracil-1 low molecular weight ribonucleoprotein，U1RNP）抗体、抗SSARo60抗体、抗SSB抗体、抗Rib-P抗体、抗Scl-70抗体和抗Jo-1抗体。抗ds-DNA抗体（试剂盒由爱尔兰Trinity Biotech Plc公司生产）与抗核小体（nucleosome，Nuc）抗体（试剂盒由德国Euroimmun公司生产）采用酶联免疫法在Sprint XL仪器（德国Euroimmun公司）上检测，临界值分别为77.0 IU/mL和20 RU/mL，样本吸光度（A）值/标准品A值≥1.0。样本检测严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0、GraphPad Prism 5.01软件进行统计分析。正态分布数据以x ±s表示，采用t检验分析。非正态分布数据采用中位数（四分位数）表示，用中位数检验进行分析。相关性采用Spearman相关性分析，指标的诊断效能采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AID组ANA阳性率及主要核型分析

AID组ANA阳性率为88.4%（1 684/1 905）。核型检出以均质型[37.8%（720/1 905）]、核颗粒型[32.9%（627/1 905）]、混合型[8.8%（168/1 905）]为主，其中混合型主要为核颗粒/胞浆颗粒[30.95%（52/168）]、均质/胞浆颗粒[11.3%（19/168）]、核膜/胞浆颗粒混合[10.71%（18/168）]，前2种混合型可见于各种AID，核膜/胞浆颗粒多见于AIH、PBC。见表1。

表1 不同AID患者ANA核型分布 [例（%）]

2.2 AID患者的ANA滴度分布

AID患者ANA滴度（中位数）为1∶320，其中AS（1∶80）、RA（1∶160）、IM（1∶160）患者ANA滴度（中位数）≤1∶160，其余AID患者均以高滴度（≥1∶320）为主。ANA主要核型滴度（中位数）分别是均质型1∶320、核颗粒型1∶640、混合型1∶320、胞浆颗粒型1∶320、着丝点型1∶320。见图1、图2。

图1 不同AID患者ANA的滴度（中位数）

图2 不同AID患者核型滴度分布

2.3 风湿类AID患者相关自身抗体检出情况

1 811例确诊风湿类AID患者血清各种自身抗体检出率差异明显，ENA谱中检出率居前3位的依次为抗SSA-Ro60抗体（40.9%）、抗U1RNP抗体（19.2%）、抗SSB抗体（10.8%）。ANA、ENA谱阳性符合率为51.1%（926/1 811）。见表2。

表2 不同风湿类AID患者相关自身抗体的检出情况 [例（%）]

2.4 SLE患者ANA滴度与抗ds-DNA抗体的相关性分析

1 001例确诊SLE患者ANA滴度与抗ds-DNA抗体呈正相关（r=0.394，P＜0.01），抗ds-DNA抗体阳性率为45.25%（453/1 001）。抗ds-DNA抗体阳性、阴性组滴度（中位数）分别为1∶640和1∶320 （P=0.00）；按核型分类，仅核颗粒型、均质型ANA滴度（中位数）差异有统计学意义（P=0.00）。见图3。

图3 抗ds-DNA抗体阴性、阳性的SLE患者ANA滴度的分布

2.5 小儿SLE与成人SLE自身抗体阳性率的差异

在1 001例SLE患者中成人898例（年龄17～88岁），小儿103例（年龄1～16岁）。成人SLE组与小儿SLE组ANA滴度（中位数）分别为1∶640和1∶320 （P=0.00）。见图4。2组间女性占比及ANA、抗U1RNP抗体、抗ds-DNA抗体、抗Nuc抗体阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

图4 成人SLE与小儿SLE患者ANA滴度的分布

表3 小儿SLE与成人SLE患者自身抗体水平的比较 [例（%）]

2.6 健康体检者ANA核型与滴度分析

4 433名健康体检者ANA阳性率为12.8%（568/4 433），主要核型为均质型[42.8%（243/568）]、核颗粒型[37.2%（211/568）]、核仁型[6.9%（39/568）]，滴度（中位数）为1∶80。高滴度组（≥1∶320，0.9%）和低滴度组（1∶40～1∶160，99.1%）女性占比分别为76.3%和44.6%（P=0.001）。

AID组和健康体检组ANA滴度（中位数）分别为1∶320、1∶80（P=0.000），对2组的ANA滴度进行ROC曲线分析，当滴度分别为1∶80、1∶160时，ANA的敏感性分别为97.1%和80.1%，特异性分别为38.7%和80.8%。见图5。

图5 AID组与健康体检组ANA滴度的ROC曲线

3 讨论

自身抗体是诊断AID的重要依据，每种AID都伴有特征性的自身抗体谱。以往报道的结果多为小样本研究，且各学者报道也存在较大的差异。本研究通过大样本分析了不同自身抗体在不同AID中的差异及健康人群ANA的检出情况，结果显示AID组ANA阳性率为88.4%，与文献报道[4]基本一致，其中均质型在SLE、RA、PSS及核颗粒型在SS、MCTD中的阳性率高于其他核型，这与各疾病特异性靶抗原的抗ds-DNA/Nuc、抗SSA/SSB、抗U1RNP等抗体在Hep-2细胞内荧光染色位置具相关性有关[5-7]；RA中ANA阳性率高达72.3%，且以均质型为主，与文献报道[8]较为一致，RA患者中检出抗ds-DNA抗体（2.8%）、抗Sm抗体（1.2%），可能与上海交通大学医学院附属仁济医院就诊患者疾病复杂性相关，部分患者并发SLE；PBC、AIH核型以混合型、胞浆颗粒型阳性率较高，主要与PBC、AIH血清中常见的特异性抗线粒体抗体、gp210、sp100、抗平滑肌抗体等靶抗原阳性有关[9]，说明通过某些特殊核型分析可为AID（如PBC/AIH）诊断提供重要依据。

各类AID患者ANA滴度（中位数），除AS（1∶80）、RA（1∶160）、IM（1∶160）外，以高滴度（≥1∶320）为主，与周仁芳[4]等的大样本研究结果相符。RA患者可检出低滴度ANA，主要原因可能为RA的特异性抗体如抗角蛋白抗体主要识别食管上皮细胞的丝集蛋白[10]，故少见以Hep-2细胞为基质的ANA呈高滴度阳性；另一种可能的原因是AID的发病机制复杂，每种AID都可产生各种不同种类或不同亲合力的自身抗体，造成某些AID以低滴度ANA检出为主，有文献报道AS患者ANA阳性率在18%左右，且以低滴度为主[6]，与本研究结果一致。因此，在诊断AS、RA、IM时ANA滴度的参考意义不大。

目前有关 ANA 核型、滴度与病情活动的相关性报道比较少，本研究发现SLE患者抗ds-DNA抗体阳性组的ANA滴度（中位数）明显高于抗ds-DNA抗体阴性组（P＜0.01），ANA滴度也与可作为病情监测指标的抗ds-DNA抗体呈正相关（r=0.394，P＜0.01）。小儿SLE在很多方面与成人SLE相似，但小儿SLE临床表现多样、严重程度相差悬殊，该疾病病因不明确。有文献报道抗SSA抗体、抗SSB抗体属于IgG型自身抗体，可经过胎盘屏障进入胎儿的血液循环，与胎儿或新生儿狼疮发生相关[11]。本研究小儿SLE组女性占比明显少于成人SLE组（P＜0.01），与尧雨根[12]的研究结果相符；成人SLE组ANA、抗ds-DNA抗体、抗Nuc抗体、抗U1RNP抗体阳性率明显高于小儿SLE组 （P＜0.05），可能与小儿起病隐匿、疾病初期血清ANA少，医学技术的进步和人们健康意识的提高，早在发病前确诊等有关。

ANA在“健康人群”呈弱表达，在一定程度上干扰了AID的早期诊断。在本研究健康体检人群中ANA阳性率为12.8%，与钱培新等[13]报道的13.45%相近，而ANA在健康人群中的阳性率会随着年龄增加而升高，70岁以上的老年人ANA阳性率可达21.32%[14]。目前ANA阳性滴度临界值仍存在较大的争议，国内缺乏统一的滴度稀释系统和标准化报告程序。同时，自身抗体检测的敏感性和特异性往往相悖，因此临界值的设定很重要，而实际应用中根据不同的检测目的，可能需要设定不同的临界值。本研究对AID组与健康体检组ANA滴度的诊断效能进行ROC曲线分析，结果显示1∶80滴度敏感性（97.1%）好，特异性（38.7%）差，适合健康体检筛查；1∶160滴度敏感性（80.1%）、特异性（80.8%）均较为理想，适合疾病辅助诊断。

通过本次分析，了解不同AID患者ANA核型、滴度分布情况，风湿类AID以均质型、核颗粒型为主，消化类AID则以混合型和胞浆颗粒型为主，除AS、RA、IM外，其他AID均以高滴度（≥1∶320）为主，说明通过某些特殊核型分析可为AID（如PBC/AH）的诊断提供重要依据；SLE患者中ANA滴度与抗ds-DNA抗体呈正相关，临床应重视ANA核型和滴度的临床价值。另外，临床可将1∶160作为ANA阳性临界值，而1∶80滴度适合用于健康体检筛查。

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