临床实验室质谱检测原理

张 岩， Thomas Jackson

（美国罗彻斯特医学院病理和检验系，罗彻斯特 14642，美国）

临床实验室质谱（mass spectrometry, MS）技术在临床实验室中的应用随着MS分析仪的创新不断拓展。最早的MS分析仪采用扇形电场及磁场实现质量分离，体积大、价格贵。随着四极杆MS分析仪与色谱分离、第1代气相色谱（gas chromatography，GC）及液相色谱（liquid chromatography，LC）技术的联用，大大提升了MS技术的实用性。三重四极杆等多重MS技术的联用与LC分离技术令检测向高敏、可重复、定量方向发展，这是目前临床实验室开展MS检测的基础[1]。随着MS分析仪的不断发展及轨道阱（Orbitrap）MS分析仪的诞生，LC-MS的联用更是如虎添翼。

采用GC/MS对类固醇[2]及有机酸[3]进行检测是MS技术最先在临床实验室应用的项目。继串联MS检测酰基肉碱诊断新生儿遗传代谢病（inborn error of metabolism，IEM）后，其在临床检测中的应用开始加速[4]。LC-MS联用尤其是与串联四极杆MS联用时，能实现对小分子药物及其代谢产物的量化检测，促进了该领域仪器研发的进步[5]。治疗药物监测与毒理学的迅速发展在提升仪器灵敏度及实用性的同时，进一步扩大了MS技术的应用范围[6]。

1 仪器

1.1 MS分析仪类型

MS分析仪可对单个分子或分子片段进行质量分析，要求被分析对象带电荷并呈气相，一般由紧密相连的离子源、质量分析器及检测器3个部分组成。离子源外接样品引入系统，是离子生成的部位；多数MS分析仪的质量分析器根据离子质荷比（mass-to-charge ratio，m/z）区分离子；检测器将离子分别转换成信号并传入仪器数据处理系统，由数据处理系统控制整个仪器。

MS技术具有较高的特异性，尤其在与可重复色谱分离技术联用时，其检测结果可作为许多临床检测的“金标准”。也就是说，该技术可作为其他特定分子浓度检测手段的校准方法。仅当某方法被作为参考方法且检测严格按照书面程序进行时，可将液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）作为“金标准”。但由于MS分析仪系统复杂、维持其精密度以获得准确的结果亦具有一定难度，MS技术常被视作“无其他方法可用时的最佳技术”。

MS分析仪根据m/z[离子质量（相对原子质量）÷ 电荷数]分析被测物的质量。例如，25-羟基维生素D3的相对原子质量为400，当加入1个质子[（400+1）个质子]而带单电荷时，可在m/ z为401处被检测到；当加入2个质子而带双电荷时[（400+2）个质子，402/2 = 201]，可在m/z为201处被检测到。通常以m/z衡量准确度，检测越准确则分子式鉴定能力越强。仍以25-羟基维生素D3为例，其分子式为C27H44O2，分子离子经质子化后的相对原子质量为401（加入1个质子形成C27H45O2），其精确质量保留至5位小数，为401.341 97。尽管经质子化的C27H45O2（25-羟基维生素D3，m/z为401.341 97）与C28H49O（菜油甾醇，m/z为401.370 52）之间的质量差异仅为0.028 55，但MS技术仍可通过m/z精确区分两者。检测误差决定了质量检测结果所对应的潜在分子式的数量。高分辨质谱仪（high resolution mass spectrometer，HRMS）能精确离子m/z。

整体准确性及有效位数层面的质量检测能力是区分不同类型MS分析仪的标准之一。为提升整体准确性，MS分析仪常采用四极杆作为质量过滤器。四极杆由4根杆组成，以相对的2根杆为1组，通过在2组杆上施加相抵消的直流电高频电压来实现质量过滤。许多MS分析仪都可提供准确的质量信息，如检测加速离子飞行时间的飞行时间（time of flight，TOF）MS分析仪[7-8]，检测捕获离子振荡频率的分析仪——利用磁场捕获离子的傅里叶变换质谱分析仪（Fourier transform mass spectrometer，FTMS）与通过经典吸引平衡离子惯性进行捕获的轨道阱MS分析仪[9-11]。

多重MS技术的联用令MS分析仪能够在离子水平上同时进行多项临床实验。由3个紧密联系的四极杆分析仪组成的三重四极杆较为常用，其常见的工作模式见图1[12]。最简单的模式是全扫描，在质量分析器设定的扫描范围内采集生成的全部离子的信号，Q1与Q3同时进行扫描，Q2设置为所有离子可通过、不含碰撞气体，见图1（a）；产物离子扫描可对不同质量的分子进行定量检测，Q1设置为仅特定m/z的离子可通过，Q2中充入碰撞气体令离子碎片化，Q3对片段产物进行扫描，见图1（b）；母离子扫描可用于确定一类待测物中的所有母离子，识别共同碎片并观察产生该碎片的所有母离子，由Q1进行扫描，在Q2中通过碰撞气体使离子碎片化，Q3仅识别特定m/z的离子，该模式可检测单个样品中所有糖基化类型，见图1（c）；与母离子扫描相近的是中性丢失扫描，该模式对Q1与Q3同时进行扫描，将两者质量抵消偏移，Q2中充入碰撞气体进行离子片段化处理，可通过观察m/ z为18（相当于水）处的中性丢失情况来识别所有含羟基的离子，见图1（d）；选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）为一种三重四极杆分析仪常用的模式，可用于定量分析，Q1与Q3用于质量分析，Q2通过碰撞气体进行碎片化反应，见图1（e）。SRM进一步升级即为多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），MRM以SRM为基础，利用数据控制系统循序选择多重反应类别。当MS分析仪连接色谱分离入口时，该模式尤显重要。多重母子离子对即母离子与碎片离子的组合，可在特定时间内对色谱洗脱出的特定待测物进行监测。如采用化学性质与待测物相同的同位素标记标准品，则标准品与待测物的母子离子对同样可通过MRM进行监测。各母子离子对的观察时间短且与色谱层析图谱峰宽相关，可准确测量峰面积并计算待测物浓度。SRM与MRM的特异性大幅提升了试验信噪比，提高了灵敏度。

图1 三重四级杆工作模式

串联四极杆可与精密质量仪联用，较常见的包括Qq-TOF、Qq-FTMS与Qq-Orbitrap[Q代表扫描四极杆，q代表碰撞（碎片）四极杆]。这类仪器可运行上述所有模式，其检测结果更为准确。

1.2 离子化

MS分析均以离子为基础，故待测物经MS分析仪检测前需进行离子化，是MS检测的基本操作。MS分析仪采用过各类离子源，不断推陈出新，就像许多MS分析仪曾风靡一时但如今不再使用一样。

目前，临床实验室MS检测常用的是LC技术，LC-MS检测最常涉及的电离方式有3种：电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）、大气压化学电离（atmospheric-pressure chemical ionization，APCI）及大气压光电离（atmospheric-pressure photoionization，APPI）。（1）ESI最为常用，尽管工作机制尚未完全明确，但重要的是ESI过程始于对预制离子液的雾化[13]。液滴随着溶剂分子的“挥发”而不断收缩，直至库仑爆炸令其碎片化。该过程持续至溶剂完全去除，留下带电离子经过锥孔（大小需满足维持分析过程中的真空需求）进入MS分析仪。同轴气流可辅助雾化，附加气流利于溶剂蒸发，两者均可提高流速。电喷雾常产生多种带电离子，增加电荷数量可提升MS分析仪的有效检测范围。（2）APCI采用LC流出物气流辅助喷射技术，通过电晕针放电令溶液分子产生活性成分，使待测物分子质子化或去质子化，生成MS分析所需的带电物质。（3）APPI同样采用气流辅助雾化，但通过紫外线光源对待测物直接电离，或对掺入喷雾的助剂分子进行电离从而使待测物离子化。尽管APPI仅适用于含芳香基团的特定类型待测物，但其信噪比极佳，故分析灵敏度非常高。这3类离子化技术均可与其他类型流体色谱法联用。ESI与APCI常产生质子化分子离子，通过向待测物添加1个质子（H+）来观察带正电荷的离子，或通过分子离子去质子化（去除H+）来观察带负电荷的离子。APPI常通过丢失1个电子产生激发态阳离子。这3类离子化技术均属于“软”电离技术，主要产生准分子离子，通过检测待测物中所有特定m/z的离子来提高其灵敏度。

GC是与MS分析仪最早进行联用的色谱技术[14-15]，在临床实验室已有较丰富的应用经验，但该技术如今已不及LC运用普遍。GC/MS采用电子轰击（electron impact，EI）电离技术，优势在于不同仪器所获得的结果重复性较好，能提供大量信息，可外接数据库能辅助鉴定化合物。与APCI相似，GC亦可向离子源中加入附加反应物，使其离子化并反应生成可与待测物进一步反应的物质，经质子化或去质子化形成带正电荷的阳离子或带负电荷的阴离子。这种离子化形式亦称化学电离（chemical ionization，CI），可减少化合物碎片质量的差异，常用于测定未知物质的相对分子质量。

并非MS技术分析的所有样品都需要进行色谱分析。基质辅助激光解吸离子化技术（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）常用于蛋白、多肽、寡核苷酸及细菌检测[16]。将待测物与吸收紫外光（ultraviolet，UV）的基质溶剂混合，点样于光滑金属板上，干燥后放入MS源，一旦达到适宜的真空状态，斑点受脉冲UV激光照射会令少量待测物自样品中释出，反应生成预形成离子或离子作为分析物进入MS分析仪。TOF MS电离呈脉冲性，常用于检测。MALDI可用于MS成像研究。

另一类已成功运用于固体样品电离的技术统称为解吸电离[17]。该技术通过ESI或APCI电离溶剂后导向固体样品。电离溶剂与固体反应后令待测物解吸并离子化，随后导入MS分析仪。该技术已可用于干血斑（dried blood spot，DBS）[18]分析及MS成像。

MS分析仪联合电感耦合等离子体（inductively coupled plasma，ICP）炬管可组成ICP-MS，能够检测金属物质。该电离法采用高温（～ 10 000 K）氩气等离子体气流分裂样品并电离。仪器可直接检测样品中的金属物质，有效开展重金属中毒筛查[19]或联合色谱分析明确待测物类别，提供有关金属物质化学环境的信息[20]。目前临床化学色谱分析中广泛采用的电离技术见表1。

表1 临床化学色谱分析常用电离技术的比较

1.3 样品导入

正如MS检测采用各类离子源一样，样品导入技术同样也有许多种。其中一些基于分离辅助混合物分析，其他则侧重于主体样品，部分具有成像功能。

临床化学最常用的2种色谱分析法为LC和GC，SFC、凝胶电泳、CE和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）等较少被采用[21]。除凝胶电泳外，其他方法均可通过表1中的电离技术直接与MS分析仪串联。SFC流动相多采用加压二氧化碳，常用于手性分子分离[22]。CE同凝胶电泳一样利用电场进行分离，但在狭小的毛细管中进行[23]。GPC亦称尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography，SEC），常用于检测较大生物分子，与传统LC不兼容[24]。

LC技术正处在仪器根本性的变革中。2004年美国Waters公司推出了超高效液相色谱（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）。该高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）系统泵的最大工作压力可达1 000 bar（15 000 psi），较以往提升了2倍，令柱化学新技术得以被采用，尤其对于较小粒径的物质，反过来提高了色谱分辨率并减少了色谱运行时间。如上述，解吸技术可用于非成像检测，也可用作二维或三维样品成像。ICP可直接将样品导入MS分析仪[25]，也可通过连接LC加以实现[19]。LC-ICP-MS技术可明确样品中金属物质的种属。

1.4 待测物类型、来源及用户群体

临床MS检测样品的制备根据MS分析仪的分析类型、待测物、进样系统及离子源而不同[26-30]。样品类型与来源对样品制备及预期的检测结果影响极大。样品制备最简单的方式是“稀释后直接进样”，正如其字面意义，该法采用可溶溶剂对样品简单稀释，常用于尿液检测[31]；另一种稍复杂的样品制备技术是蛋白沉淀，该法将溶剂加入血液样品，令蛋白凝聚并沉淀，常通过离心加强这一过程，一般无法去除样品中的基质或脂质干扰。液-液萃取是与既往技术相比具有一定优势的经典样品制备技术，但难以实现自动化。固相萃取技术使用固化吸附剂吸附待测物，可彻底清除样品中的基质或脂质干扰[32]。固化吸附剂的亲和力不同，需根据样品及待测物类型进行选择，未被吸附的干扰物经洗脱后，要采用强溶剂再次洗脱待测物。成功制备样品的关键在于通过操作达到所需的样品清洁度及充分的检出限（limit of detection，LOD）即可，超出检测所需的制备操作会增加时间与成本。常用LC-MS/MS样品制备技术的比较见表2。

GC-MS分析要注意的是：待测物应能够利用GC热挥发进行分离。如待测物分子不挥发或受热降解，则在保证样品洁净度的同时，还要进行衍生化处理令其挥发[33-34]。

MALDI及其他未涉及色谱层析分离的技术采用不同的样品制备方式。定量MALDI与LCMS/MS相似，常采用同位素标记内标加入已知浓度样品。在相同溶剂中溶解样品与基质会带来结晶、非必要沉淀等问题。微生物MS检测要求样品制备方式有较高的重复性，以便查阅。MALDI及其他成像技术则需维持样品空间构型[35]。ICP-MS需要排除受外部环境污染的可能[36]，所以对样品清洁度要求极高。

表2 常用LC-MS/MS样品制备技术的比较

2 临床实验室开展MS检测所面临的挑战

2.1 实验室自建检测项目（laboratory developed test，LDT）标准化的不足[37]

LDT指由临床实验室自行开发的检测项目。许多临床实验室开展LDT检测的方法相似，但仍缺乏标准化的基础。尽管供应商正在着手开发囊括所有针对特定待测物检测所需的试剂、柱以及包括分析软件在内的“试剂盒”，但大部分临床实验室对流动相、校准措施、质控措施以其他检测所需组件仍采用自行研发的方式。虽然在监管、标准化及室间比对等方面已做了一些努力，但不同临床实验室间的检测结果仍存在差异。

2.2 缺少合适的内标

经同位素标记的“重”标准品已经十分普遍[38]，其与待测物化学性质完全相同，但特定元素被较重的同位素所代替，如2H、13C、15N与18O等。被替代的元素数目各异，但待测物分子质量的增加要求其可与标准品易于区分，所以有必要为每个待测物都设立特定标记内标，但在检测多个待测物或仍缺乏标记物时，可考虑采用替代标准品。这种情况下，标准品的化学性质应尽可能与待测物接近，由于待测物洗出时存在干扰物质会减弱MS信号，采用同位素标记标准品可部分补偿这类离子抑制效应[39]。

ESI最易受到离子抑制的影响，APCI与APPI则较少受离子抑制影响。如利用色谱分辨率自无活性的异构体表睾酮中分离出睾酮是较为困难的[40]，因为两者质量相同且质量谱非常接近，准确定量要求一定的色谱分辨率。同样，随着对不同形式维生素D检测需求的日益凸显[41]，色谱分离需进一步努力提高分辨率。当被测物质量不同时可不采用色谱分离，色谱设备供应商已开始通过柱化学提高分辨率，但需对仪器进行更换，成本较高。

2.3 LC与GC分离所需的时间

为确保GC分析的热稳定性，特别是需要进行衍生化处理时，会延长样品制备的时间。

2.4 样品制备过程无法实现自动化[42]

样品制备需基于样品类型、待测物、分析方法、已有设备、操作人员技术水平、各批次样品数量、样品制备与仪器（柱）污染间的成本/时间平衡，因此关于何为“最佳”样品制备方法的意见尚未统一。血液、血浆与血清被视为最复杂的样品基质，需要最烦琐的制备处理，常需要多次蛋白沉淀与提取，而其他液体样品制备则较简单，可能仅需“稀释后直接进样”即可。稳定、易行的样品制备方法是实现稳定可重复的定量分析的关键之一。自动化样品制备虽然备受期待，其在高通量检测中的前景最为开阔，但前期开发耗时长且设备耗材费用高昂。

2.5 实验室信息系统的限制[43]

处理带有批次样品结果的电子数据表并进行手工输入是数据处理的限速步骤，即便数据分析是自动化的，但仍需人工进行核对，包括对检测适应症、校准和质控数据的回顾以及人工核对临床样品峰值。

2.6 专业人员的短缺[44]

操作者是结果重复性及实验室稳定运行的关键。目前，美国的许多临床实验室都存在专业人员短缺的问题。临床化学MS实验室对人员技术水平的要求高于自动化实验室，需同时具备手工样品制备、色谱及仪器日常维护能力。美国临床化学学会（American Association for Clinical Chemistry，AACC）质谱与分离分委会（Mass Spectrometry and Separation Sciences Division，MS3）等组织正努力在这方面提供更多的培训机会。

2.7 财务考量[45]

通常，MS分析仪及其相关设备的前期成本高昂，一旦方法建立后单个检测成本较低，两方面可相互平衡，但如果由实验室承担直接或间接培训成本，则花费较大。另外，MS实验室的技术人员尤其是LDT开发人员需接受大量培训来掌握丰富的经验、最先进的技术，这也需要大笔资金。

3 未来的仪器

MS技术不断发展。随着更多创新技术用于临床检测，相关仪器也不断被研发出来。LC/LC等色谱层析领域的科研进展[46]在未来几年将产生较大影响，样品制备步骤的整合及自动化（如线上自动化样品制备）同样会影响深远[47]。基于分子气相形态的创新离子迁移分离开拓了新方向。未来某些标准化定量检测仪器可能会集成纳入临床分析系统，而特定检测的相应试剂盒也会出现[48-49]。总体而言，临床MS检测领域被远大的目标所驱动着，包括：更灵敏、分辨率更高、更自动化、定量更准确、应用更广泛、与实验室信息系统整合更好。仪器系统的小型化与成本的降低令即时检验有望在医生办公室或诊所开展，发展出供筛查使用的便携式现场检测设备[50]。

4 总结

MS技术的应用虽尚未普及，但将成为临床实验室的发展重点。三重四级杆将广泛用于定量检测，MALDI-TOF MS将用于成像及微生物鉴定。检测目的、样品及基质情况决定了MS分析仪类型及离子化方法的选择。样品制备是临床MS检测的关键，方法开发过程中要对样品制备的速度、灵敏度及成本进行考虑及优化。

目前，MS检测所面临的挑战源于多方面，挑战同时也带来机遇：采用新的色谱分离技术，发明新的分析方法，发现需要检测的新分子，发布影响临床MS技术应用的新规定等。仪器的速度不断加快，灵敏度不断提升，驱动着这一最激动人心的创新领域不断发展。新一代仪器不断涌现，色谱技术也进入复兴中，其他类型MS技术的改进显著提升了TOF及轨道阱MS分析仪在定量检测中的适用性。

临床MS检测的潜力不可限量，但也充满挑战。希望这篇综述能帮助读者对MS设备及进样系统的现状有所了解，为临床应用与决策提供指导。

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