免疫刺激寡肽Neogen的合成

李 晨，陈 科，范永刚，郭 添，杨小琳，赵金礼

（陕西慧康生物科技有限责任公司，陕西 西安 710054）

随着科学技术的发展和不断创新，日臻成熟的生物技术和多肽合成技术使得越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。寡肽Neogen，又被称为IEW，其氨基酸序列为Ile-Glu-Trp，是一种具有免疫刺激剂适应症的生物活性肽，其在经过细胞抑制剂治疗、化疗、术后感染后免疫系统和造血功能的恢复方面有显著的治疗效果。

寡肽是指氨基酸数目为2～10个的生物活性肽，其特点是可以像小分子一样穿越细胞膜，通过生理屏障，吸收快速且不消耗人体能量。所以，它被用作药物载体输送到人体的细胞组织中去，并可作为多肽药物应用于医药和化妆品等领域，具有生物活性高、特异性强、副作用小的优点。目前，处于研发阶段的多肽药物成百上千，开发领域也延伸到各种适应症。

免疫刺激剂治疗是最早开展的肿瘤生物治疗。众所周知，机体具有免疫功能，但由于癌过程的渐进性、肿瘤抗原隐匿性等特定的因素，机体的抗癌免疫力远没有抗微生物免疫那么迅捷、有效。免疫激发是免疫反应的初始环节，在抗癌免疫中也是最重要的环节之一。免疫刺激剂的作用就是激发机体的免疫反应，达到抗癌免疫同时其被加强的目的。

Neogen是一种潜在的血生成刺激因子，会对造血功能机制产生影响[1]。在肿瘤化疗中，造血功能损害是一个严重的问题。大量的生物试验研究表明，Neogen会影响小鼠造血功能的恢复，可降低细胞静力学对造血的毒性作用，能有效促进小鼠血红素的恢复[2]，对造血前体细胞的增殖有积极影响，同时，也能刺激恢复血栓的形成[3]。目前，相关研究正处于临床二期。研究表明，通过对血管紧张素抑制酶抑制活性的评估，Neogen作为一种有力的抑制剂，在治疗高血压方面有较大的潜力[4]。

目前，国内、国际关于小分子多肽的生物活性的研究非常多，然而合成方案却凤毛麟角。本文简要介绍了一种固相合成多肽的方案。以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，以Fmoc保护的氨基酸为原料，从C端到N端依次缩合，合成目标肽链，将其酸解脱去树脂和各种保护基团，得到目标肽粗品，然后进行反向色谱纯化和离子交换，得到最终纯品肽。

1 实验部分

1.1 主要的原料和试剂

实验中用到的主要原料和试剂有：Fmoc-Ile-OH（吉尔生化上海有限公司）、Fmoc-Glu（OtBu）-OH（吉尔生化上海有限公司）、Fmoc-Trp-OH（吉尔生化上海有限公司）、DMF（分析纯，西安浩业化工有限公司）、DIC（吉尔生化上海有限公司）、HOBt（吉尔生化上海有限公司）、DIEA（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、DCM（分析纯，西安浩业化工有限公司）、异丙醇（分析纯，西安浩业化工有限公司）、哌啶（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甲醇（分析纯，西安浩业化工有限公司）、2-CTC Resin（吉尔生化上海有限公司）。

1.2 主要仪器

实验中用到的主要仪器有：超声波清洗器（昆山市仪器有限公司KQ-500B）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司 SHB-Ⅲ）、电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司 SE6001F）、制备高效液相色谱仪（创新通恒LC3000）、分析高效液相色谱仪（日立全自动L2000系列）、C18分析色谱柱（大连物理化学研究所4.6 mm×250 mm）、弱阴离子交换柱（自填体积为150 mL，保赛生物科技公司填料，粒径为45～165 μm的DEAE高流速琼脂糖微球）、C18制备色谱柱（成都科谱生物有限公司，50 mm×450 mm）。

1.3 实验方法

1．3．1 树脂活化

将3.0 g的2-CTC-Resin树脂（批号为G55S1131-1，交联度为1%DVB，粒径为100～200目，取代度为1.75 mmol/g）加入反应器中，加入30 mL的DCM，室温搅拌浸泡10 min使其充分溶胀活化。

1．3．2 合成 Fmoc-Trp-2-CTC Resin 肽树脂

在步骤1.3.1的树脂中加入Fmoc-Trp-OH（2.46 g）、DIEA（4 mL）、DCM（30 mL），室温搅拌反应2 h，第二次加入Fmoc-Trp-OH（2.23 g）、HOBt（1.42 g）、DIEA（1.6 mL）、DCM（20 mL），室温搅拌反应1 h，用30 mL异丙醇和30 mL的DMF各洗涤2次，得到保护肽树脂。

1．3．3 合成 H-Trp-2-CTC Resin 肽树脂

在1.3.2的树脂肽中加入100 mL质量分数为20%哌啶的DMF溶液，室温搅拌反应30 min。抽滤去除溶液，再次加入100 mL质量分数为20%哌啶的DMF溶液，室温搅拌反应10 min，除掉2-CTC Resin上的9-芴甲氧羰基基团，用100 mL的异丙醇和100 mL的DMF各洗涤2次，得到H-Trp-2-CTC Resin肽树脂。

1．3．4 合成 H-Ile-Glu（OtBu）-Trp-2-CTC Resin 肽树脂

按照步骤1.3.2和1.3.3，依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ile-OH，得到H-Ile-Glu（OtBu）-Trp-2-CTC Resin肽树脂，用30 mL异丙醇和30 mL的DMF各洗涤2次，甲醇洗涤3次，干燥后得5.1 g树脂肽。

1．3．5 合成制备三肽 Neogen

配制肽树脂切割液时，将三异丙基硅烷、三氟乙酸、苯甲硫醚和水按体积比为5∶4∶88∶3加入到烧杯内搅拌混合。切割肽树脂时，在1.3.4的肽树脂中加入50 mL切割液，室温搅拌反应2 h，过滤，三氟乙酸洗涤树脂2次，滤液在35℃浓缩至油状物，然后倾倒到冷冻的40 mL无水乙醚中，大量淡黄色固体析出，过滤，冰乙醚洗涤滤饼，得目标肽粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得到三肽Neogen纯品1.9 g，纯度大于99.5%，收率74%.

图1 Neogen最终产品HPLC分析图谱

2 结果讨论

图1为Neogen最终产品HPLC分析图谱，表1为峰结果。从图1中可以看出，Neogen最终产品的纯度大于99%，得到纯品1.9 g，产率74%.

表1 峰结果

3 结论

本文介绍了一种固相法合成Neogen的方法，这种方法具有操作简单快捷、副产物少、易于分离纯化、可重复性高的特点。与液相合成方法相比，这种方法缩短了合成时间，节省了试剂用量，中间体无需柱层析和重结晶。这次研究也为日后大规模生产提供了成熟有效的合成方案。

［1］Semina，Deigin，Vinogradova，Yu.Postradiation recovery of hemopoiesis in mice affected by Neogen（IEW）［J］.Radiats.Biol.Radioekol，2002，42（1）：70-74.

［2］TN Semenets，OV Semina，YY Vinogradova，et al.Application of synthetic immunomodulating peptides for correction of hemopoiesis in mice after administration of the cytostatic agent cytosine arabinoside（Ara-C）［J］.Immunologiya，2000（6）：20-22.

［3］Ziablitskiĭ VM，Semina OV，Semenets TN，et al.Immunogenic peptide neogen stimulates postradiation recovery thrombopoiesis［J］.Radiats Biol Radioecol，2003，43（1）：49-50.

［4］VK Jimsheena，LR Gowda.Arachin derived peptides as selective angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitors：structure-activity relationship［J］.Peptides，2010，31（6）：1165-1176.

［5］王德心.固相有机合成（原理及应用指南）［M］.北京：化学工业出版社，2004：125.