黑木耳液体发酵菌种的制作技术要点

2018-01-31王庆武乔爱丽兰玉菲

食用菌 2018年3期

王庆武乔爱丽兰玉菲

（泰安市农业科学研究院，山东泰安271000）

黑木耳（Auricularia auricular）是我国传统食用菌[1]，因营养价值高，而受到消费者的青睐，栽培面积不断扩大，生产水平稳步提高[2]。传统的黑木耳栽培所用菌种为固体菌种，每级菌种代代转接，生产周期长，菌龄不整齐[3]，污染率及成本高，生产效率低。而发酵菌种是用液体培养基，在生物发酵罐中，通过深层培养（液体发酵）技术生产的液体形态的食用菌菌种，其成本低，菌丝生长快，缩短生产周期[4]，菌种纯度高、菌龄一致、萌发快，解决了固体菌种扩大生产中难以同步性生长的问题[5]，缩短养菌时间，出耳整齐，产业综合效益稳步提高[6]。因此，黑木耳液体菌种代替传统固体菌种愈来愈受到人们的关注[7]，并逐步应用到生产中。为此，笔者重点对黑木耳液体发酵、菌种制作的环境条件、仪器设备、培养基、摇瓶菌种、发酵菌种、菌龄等进行总结，旨在为黑木耳液体发酵菌种的制作提供技术参考。

1 环境条件

发酵菌种生产场所应远离工矿业的“三废”及微生物、粉尘、烟尘，至少300 m之内无禽畜场舍、屠宰场、垃圾场，无污水和其他污染源；用水应符合GB 5749的规定。生产车间地面应防水、防渗漏、防腐、防滑、易清洗，良好的排水系统；墙壁和天花板应能防水、防潮、防霉、易清洗；车间入口设置缓冲间，门窗安装防虫纱网。

2 仪器设备

不锈钢发酵罐（包括空气过滤器，与罐体串联为一体）、空气压缩机、配电箱、高压灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、摇瓶、光学显微镜、酸度计等。发酵罐的质量应该符合GB 150的规定。

3 液体培养基

①玉米粉40 g∕L，淀粉 30 g∕L，牛肉膏3 g∕L，酵母膏 3 g∕L，磷酸二氢钾2 g∕L，硫酸镁 1 g∕L，维生素B15 mg∕L，花生油 0.5 mL∕L，pH 6.0～6.5。②玉米粉30 g∕L，淀粉40 g∕L，麸皮（煮汁）2 g∕L，酵母膏4 g∕L，磷酸二氢钾3 g∕L，硫酸镁1.5 g∕L，花生油0.5 mL∕L，pH 6.0～6.5。

4 摇瓶菌种制作

4.1 摇瓶培养基制作

液体培养基任选其一，玉米粉、淀粉先用温水搅拌均匀，混合均匀，装入摇瓶中，装液量为摇瓶容量的60%～70%，聚丙烯薄膜封口。高压蒸汽灭菌，121℃、0.11 MPa灭菌40 min，待压力自然回零后开锅取瓶。

4.2 接种培养

灭菌后摇瓶培养基冷却至30℃以下，无菌条件下，挑取5～6块1～4 mm2经活化的母种块放入摇瓶内，封口，避光静置24 h后置于恒温摇床上，温度24～28℃、转速140～160 r∕min，培养7～8 d。

4.3 摇瓶菌种标准

培养液澄清透明不浑浊，无杂菌、无异味；菌丝球（或菌丝片段）均匀悬浮于液体中不分层，直径不大于2 mm。

5 液体发酵菌种制作

5.1 灭菌与装罐

臭氧机臭氧环境灭菌40 min，待臭氧耗尽后即可操作。液体培养基任选其一，培养液无结块，打开罐盖，装入发酵罐内，加清水定容，装液量为发酵罐容量的70%～80%。通入空气搅拌1～2 min，混合均匀，密封盖口。

5.2 灭菌

发酵罐加热层通入冷水，水位低于排水口20 cm，关闭进、排水阀门；高压蒸汽灭菌，待压力达到0.05 MPa时缓慢打开排气阀降压至0，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa，同时打开空气过滤系统蒸汽灭菌50 min。

5.3 冷却

灭菌结束，缓慢打开空气过滤系统排水阀门和加热层进水阀，加热层立即通入冷水降温，同时缓慢打开罐体排气阀降压。待发酵罐内压力接近0时打开空气压缩机，经空气过滤系统向罐体内通入无菌空气，搅拌培养液，调整罐体排气阀，维持罐压正压。发酵罐内培养液温度降至30℃以下时，关闭进水阀门，调节排气阀，维持罐压0.04～0.05 MPa。

5.4 接种

关闭罐体进气阀门和空气压缩机，调节罐体排气阀，将罐压降至0，无菌条件下（接种口用75%酒精擦拭，并用95%酒精灼烧，火焰圈套在接种口上）快速将摇瓶上的胶管插在接种口上，撤掉火焰圈，打开接种口阀门，接入已经确认无任何污染的摇瓶菌种，接种量1%～2%，关闭接种口。

5.5 培养

继续通入无菌空气，调节罐体排气阀，维持罐压0.01～0.03 MPa，培养温度24～28℃，培养8～10 d。

5.6 质量检测

接种后每间隔2 d，无菌条件下由取样口取样50 mL，接种于GB 4789.28规定的试管斜面或平板培养基上，置于30℃恒温培养1～2 d，检测有无杂菌侵染，确定继续还是终止培养；取样于光学显微镜下观察菌丝体形态特点，若发现异常菌丝体则生长不良，终止培养；取样测定菌液酸碱度，判断菌液的优劣；也可鼻嗅罐体排气阀排出的气体味道，无异味，有培养基料香味及黑木耳特殊的味道可继续培养，有酸臭味终止培养。四种检测方法结合检测效果最佳。