内质网应激PERK通路在肿瘤中的研究进展

欧阳仲瑞 柴 双 赵海杞 综述 刘耀华 审校

目前，肿瘤仍是威胁人类健康的主要疾病之一，肿瘤在分子水平的研究已成为当今热点。实体肿瘤在生长过程中会引起缺氧、营养物质缺乏、活性氧和氮质堆积等肿瘤微环境的变化，进而导致大量未折叠或错误折叠蛋白聚集于内质网产生内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS可启动未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)并通过多种复杂机制促进肿瘤细胞生存、增殖、侵袭及保护性自噬，同时一定程度的UPR可诱导肿瘤细胞凋亡及自噬性死亡。UPR主要通过三种信号通路应对细胞内ERS：蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase-like ER kinase，PERK)-真核细胞翻译起始因子2α(Eukaryotic initiation factor-2α，eIF2α)-活性转录因子4(Activating transcriptional factor4，ATF4)通路、肌醇需求酶1α(Inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α)-X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)通路以及活性转录因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)通路。其中PERK-eIF2α-ATF4通路(以下简称PERK通路)最为关键且研究较为充分，本文对PERK通路在肿瘤中的相关研究进展做一综述，为肿瘤治疗提供新的思路。

1 PERK通路的构成与激活机制

PERK为Ⅰ型内质网跨膜蛋白，隶属eIF2α上游激酶家族，其主要结构包括信号肽与跨膜结构域。细胞质内的C端是它的主要功能区，可使eIF2α发生磷酸化，又可使PERK自身磷酸化，称为效应结构域。内质网侧的N端具有感受ERS信号的作用，称为传感器结构域。在真核生物中，有多种翻译起始因子(eIFs)参与协助完成翻译起始，eIF2作为通用的翻译起始因子经磷酸化修饰后对翻译起始起负调控作用。eIF2的主要功能是以eIF2·GTP·Met-tRNAi三聚体的形式转运Met-tRNAi，其α亚基肽链的第51位为保守的丝氨酸残基，能被激活的PERK磷酸化[1]。ATF4是cAMP反应元件结合转录因子家族成员之一，合成后转位至细胞核内，作为活化的转录因子特异性地提高某些基因如：MAP1、LC 3B、VEGFA、CHOP、cyclinD1等的转录水平[2]。

当真核细胞未发生ERS时，PERK N端的管腔侧与免疫球蛋白结合蛋白(Binding immunoglobulin protein，BIP)结合，形成一种结构相对稳定的无活性的复合物，而无法发生磷酸化。当发生ERS时，内质网内大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白与PERK竞争同BIP结合，从而使PERK暴露出来，PERK发生自身二聚化与磷酸化并触发UPR。磷酸化的PERK导致eIF2的α亚基上第51位丝氨酸也发生磷酸化从而抑制翻译起始复合物中GDP与GTP的交换以降低内质网内蛋白负荷[3]，同时磷酸化的eIF2α促使ATF4的表达上调。

2 PERK通路与肿瘤

2.1 PERK通路促进肿瘤细胞生存与增殖

在实体肿瘤生长早期，肿瘤生长速度超过现有的脉管供应系统，导致肿瘤微环境中关键营养物—葡萄糖和氧气的缺乏。肿瘤细胞可通过激活PERK通路启动UPR提高对不良微环境的适应能力以促进肿瘤生存和增殖。Bi等[4]证明了在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts，MEFs)内抑制PERK基因会降低细胞蛋白合成的抑制力与对低氧环境的耐受程度。并且他们还发现，将等量经RasV12激活癌化的PERK+/+MEFs(A)和PERK-/-MEFs(B)注射入小鼠腹腔，经过3～4周的观察后结果显示A组小鼠的腹腔肿瘤比B组更大且生长更为迅速。在PERK-eIF2α降低内质网对新合成蛋白折叠需求压力的同时，ATF4通过介导精细的调节机制参与氧化应激、氨基酸合成、蛋白质折叠和分化等过程以保护肿瘤细胞免受不良应激条件的干扰[5-6]。胡亚玲等[7]发现低糖条件能够保护结直肠癌细胞抵制抗肿瘤药奥沙利铂(Oxaliplatin，LOHP)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)诱导的细胞凋亡，并且诱导ATF4表达。同时该研究还发现在低糖条件下的结直肠癌细胞中敲除ATF4可以增加药敏、诱导凋亡并且在ATF4过表达的结直肠癌细胞中敲除ATF4也可以增加药敏与诱导凋亡。以上证明ATF4作为PERK的关键下游基因可能通过PERK依赖性相关机制帮助肿瘤细胞抵抗低糖微环境。PERK通路也参与促进肿瘤复发和耐药相关的重要机制-肿瘤休眠的激活。Pyo等研究证明ROS条件诱导激活的PERK通路可介导cyclinD1的降解，抑制PERK通路可显著延缓cyclinD1的降解并极大缩短G2期[8]。因此，PERK通路的激活可促进肿瘤细胞周期停滞并进入睡眠状态，以便肿瘤细胞从缺氧条件下恢复并降低其对化疗药物的敏感性。此外，Han等发现在低氧或低糖环境下BIP过表达的人肾癌细胞系中检测到细胞增殖加强，而敲除PERK基因后此效应消失[9]。以上研究说明PERK通路的激活有利于肿瘤适应不良微环境，提高了肿瘤细胞在不良条件下的生存与增殖能力。

2.2 PERK通路促进肿瘤细胞侵袭

侵袭性是肿瘤最重要的生物学特性之一，也是肿瘤手术根治困难及复发、转移的重要原因。最近多项研究发现PERK通路可通过诱导新生血管生成、降解细胞外基质(Extracellular matrixc，ECM)、介导上皮细胞间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)等促进肿瘤细胞侵袭。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是诱导肿瘤血管形成作用最强，特异性最高的血管生长因子，在诱导血管生成及内皮细胞生长、促进肿瘤细胞侵袭及转移等方面发挥重要作用。近年来许多研究显示PERK通路的激活可上调肿瘤细胞VEGF的表达诱导肿瘤内血管生成以提高肿瘤细胞的侵袭性[10-12]。基质金属蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases，MMPs)可通过降解ECM这一重要组织学屏障促进肿瘤侵袭。Sanda等发现由氧化低密度脂蛋白诱导激活的PERK通路可促进MMP-9的表达和分泌[13]。EMT是在人体中占恶性肿瘤90%以上的上皮细胞癌侵袭转移的一个重要途径，并且与肿瘤细胞耐药性密切相关。Feng等研究发现，EMT通过激活PERK通路促进了肿瘤细胞侵袭，抑制PERK降低了发生EMT的肿瘤细胞的侵袭、转移能力。并且，他们还证明在人肿瘤组织中，EMT的表达受ECM基因及PERK通路基因表达的强烈影响，而与UPR的另两条通路无关[14]。上述研究表明PERK通路不仅与肿瘤生存、增殖有关，还可通过多种方式促进肿瘤侵袭。

2.3 PERK通路促进肿瘤细胞凋亡

UPR具有双重效应，在适度的ERS条件下UPR作为一种适应性反应促进肿瘤细胞生存并恢复稳态，然而当ERS对肿瘤细胞损伤程度超过UPR的处理能力时，UPR可以促使肿瘤细胞发生凋亡[15]。介导UPR的PERK通路并不会直接引起肿瘤细胞凋亡，而是由PERK、eIF2α、ATF4三者形成复合物诱导转录因子CHOP表达，并使CHOP蛋白大量堆积在细胞核中，被活化的CHOP蛋白可通过调节其他相关凋亡蛋白的表达促进肿瘤细胞凋亡[16]。李晓娟等研究证实PERK通路可促进丹参二萜醌诱导的肺癌PC9细胞的凋亡，并且与CHOP蛋白的表达密切相关。研究发现，随着丹参二萜醌浓度的增加，对PC9细胞增殖的抑制作用增加，凋亡率显著增高；随着时间延长，PERK、EIF2α蛋白磷酸化水平明显增加，8 h达到高峰；其下游蛋白ATF4表达量逐渐减低，CHOP逐渐增高，且呈剂量依赖性。PERK蛋白干扰后研究得到与干扰前相反的结果：与空载体组比较，丹参二萜醌诱导PC9细胞凋亡被明显抑制；PERK、EIF2α蛋白磷酸化水平明显降低，ATF4表达量有所增加，而CHOP表达有所降低[17]。上述研究可知，PERK通路可通过CHOP等一系列下游信号分子介导肿瘤细胞凋亡，但是其调节下游信号分子的具体机制仍需进一步研究。此外，Hiramatsu等在人宫颈癌细胞系、肝癌细胞系及结肠癌细胞系中发现PERK通过eIF2α下调抗凋亡因子XIAP合成，并通过表达ATF4促进XIAP降解，最终促进肿瘤细胞凋亡[18]。

2.4 PERK通路促进肿瘤细胞自噬

当处于缺乏营养和缺乏足够的内质网折叠蛋白质的环境时，肿瘤细胞可通过ERS/UPR上调胞内自噬相关蛋白的表达与引发自噬体的形成启动自噬进程[19]。目前研究显示ERS诱导与自噬相关分子途径包括：PERK途径、IRE 1-JNK-Bcl-2途径及ATF6-XBP 1-ATG途径[20]。Kouroku等的早期研究证实在小鼠胚胎癌细胞和成纤维细胞中，polyQ72的积聚可激活PERK通路从而启动自噬进程并且上调Atg12的表达[21]。Hasanain等在人肺癌细胞中发现α-Solanine介导的氧化应激可激活PERK通路从而诱导自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，并且沉默PERK后可检测到LC3Ⅱ表达水平的显著降低[22]。Hart等在对人神经母细胞瘤及淋巴瘤等多个遗传模型的研究中证明c-Myc和N-Myc可激活UPR的PERK通路，导致肿瘤细胞启动保护性自噬，而在抑制PERK基因后能显著降低Myc诱导的自噬过程、集落形成和体内实体肿瘤生长[23]。以上证实了PERK通路的激活对于肿瘤细胞启动自噬进程是必须的，但是细胞通过PERK通路启动自噬的具体机制仍待进一步的研究。值得注意的是，与UPR相似自噬同样既可以促使肿瘤细胞生存、增殖又可以促使其死亡[24]。但PERK通路在自噬促使肿瘤细胞死亡进程中的作用未有研究详细阐述。

2.5 PERK通路在肿瘤治疗中的应用

目前，许多研究的主要目标是应用药理学手段找到一种将UPR信号从促进肿瘤细胞表达转化为促进肿瘤细胞凋亡的方法。有研究显示氟西汀通过PERK通路介导的CHOP依赖性细胞凋亡通路，可引起大鼠胶质瘤细胞凋亡并增强其对化疗药物替莫唑胺的敏感性[25]。新生血管对肿瘤细胞增殖及侵袭具有重要意义，已有报道证明一种PERK抑制剂GSK2656157可通过降低肿瘤新生血管密度来抑制肿瘤的生长[26-27]。除化疗外，PERK通路对肿瘤的放射治疗也有重要影响。在乳腺癌细胞中使用放射线诱导激活PERK通路，磷酸化的eIF2α、ATF4和LAMP3表达水平也随之提高，敲除上述基因后，乳腺癌细胞对放疗的敏感性随之提高。此外，Nagelkerke等研究了PERK抑制剂GSK2606414对人乳腺癌细胞的影响，结果显示应用该抑制剂成功地将乳腺癌细胞内的LAMP3 mRNA表达降低了50%，并且提高了癌细胞对放疗的敏感性[28]。通过以上研究结果可知，PERK通路作为肿瘤治疗中的重要靶点，研究其相关作用机制无疑可为肿瘤放化疗提供新的方向。

3 小结与展望

目前，肿瘤作为严重威胁人类健康的常见疾病之一，对其开展分子水平的研究以及开发新的有效治疗靶点有着重大意义。本文综述了内质网应激PERK通路对肿瘤细胞生存、增殖、侵袭、凋亡及自噬的影响。针对PERK通路进行干预将为抗肿瘤药物的研发及肿瘤临床治疗方式的探索提供新的方向与思路。目前PERK通路及其下游信号分子在肿瘤中的作用机制尚未完全阐明，随着方法的改进、探索的深入，相信针对PERK通路的研究一定会为肿瘤治疗开辟新的天地。

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