发酵核桃粕复合粉中乳酸菌保护剂的筛选

顾苑婷,徐素云,丁小娟,赵泽伟,丁筑红

(贵州大学 酿酒与食品工程学院,贵州 贵阳 550025)

核桃粕(walnut dregs)是核桃经榨油后其主要的副产物,其蛋白质含量在40%左右[1],富含人体所需的各种氨基酸,脂肪含量低,符合老年人的饮食要求。据报道,从核桃粕中提取的生物活性肽具有调节高血压、增强抗氧化能力、缓解疲劳等功能[2-4],因此可利用核桃粕生产高蛋白核桃粉直接饮用或作为半成品添加在面包、蛋糕等各类糕点中[5-6]。此外也可生产低脂核桃乳[7]或复合类低脂核桃乳[8]。乳酸菌保护剂是为了保护乳酸菌在加工过程中免受损害,最大限度的保持原有的各种生理生化活性的物质,现阶段主要用于乳酸菌菌种的保藏,而在发酵乳制品中的开发和利用方向较少,在未来的发酵乳开发中具有良好发展前景[9]。薏米中含有的薏苡仁酯、薏苡仁多糖、薏苡仁油等成分有抗肿瘤[10]、增强免疫力[11]、镇痛消炎[12]等作用。而薏米经焙烤后制成的粉末,添加到其他食品中,不但改善食品的品质,还提升了食品的风味。国内外研究者主要集中在对核桃蛋白饮料的加工工艺和配方设计,多为调配性饮料的研究,对发酵型核桃乳的研究较少,现在的大多数核桃乳开发制作工艺当中,原料基本上是把核桃乳和其他植物蛋白混合作为生产的基础原料,如杏仁[13]、花生[14]、枸杞[15]等,鲜有薏米与核桃粕复配的研究。

本研究从核桃粕的开发利用的现状出发,以发酵核桃粕复合乳为试验原料[16],在发酵核桃粕复合乳中添加乳酸菌保护剂,开发一种富含活菌的发酵型固态方便食品。提高原料高值化利用水平以及产品营养保健特性,重点探讨核桃粕乳酸菌固体饮料的加工关键技术,确定发酵核桃粕复合粉加工中最佳保护剂及其配比,提高产品活菌含量,以期为完善优化发酵核桃粕复合粉的工艺提供重要技术来源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃:市售,饱满,无损坏变质核桃,经压榨去油后得到核桃粕备用；薏米:市售,无霉烂、无变质,于120℃条件下烘烤20 min,然后超微粉碎机粉碎15 min,过300目筛得到薏米粉[17]。

谷氨酸钠、脱脂乳粉、海藻糖、麦芽糊精、蔗糖、阿拉伯胶、甘油(均为食品级)、RB复合稳定剂:上海健鹰食品科技研究所；无水乙醚、乙醇、丙酮、异辛烷(均为分析纯):天津市赋予精细化工有限公司；氯化钠、硫代硫酸钠、碘化钾、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾(均为分析纯):成都金山化学试剂有限公司；硫酸、盐酸、硼酸(均为分析纯):重庆联瑞化工有限公司；千里香酚蓝、冰乙酸(均为分析纯):成都科龙化工试剂厂；淀粉(食品级):徐州人和居食品厂。

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum):贵州轻化工中心；平板计数琼脂:北京陆桥技术股份有限公司；MRS培养基、MRS琼脂培养基:实验室自制。

1.2 仪器与设备

S-3400N扫描电子显微镜:日本HITACHI(日立)公司；RT-25气流式超微粉碎机:长沙市常宏制药机械设备厂；JM60立体胶体磨:温州市鹿城区市中精益胶体磨机；GJJ-0.06/60高压均质机:上海诺尼轻工机械有限公司；LD4-2型离心机:北京医用离心机厂；SKD-800半微量凯式定氮仪:上海旦鼎国际贸易有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台:苏州净化设备有限公司；SHP-250型智能生化培养箱:上海兴都仪器设备有限公司；B-290型喷雾干燥机:瑞士Buchi实验室仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵核桃粕复合粉的加工工艺流程及操作要点

发酵核桃粕复合粉的制备[18-20]:核桃粕与水以1∶8质量比混合,进行磨浆均质灭菌后得到核桃粕汁。对嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌将进行活化复壮,当活菌数＞106CFU/mL(即为对数期)停止活化。将活化好的嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵菌液以1∶1的比例混合,按3%的接种量(V/V)加入核桃粕复合汁中,于38℃条件下发酵时间6 h,得到发酵核桃粕汁。将原料按以下比例混合,即发酵核桃粕汁27%、薏米粉2.0%、蔗糖5%、RB复合稳定剂0.35%、水65.65%,得到发酵核桃粕复合乳。均质[21]:采用30 MPa的均质压力,在75℃条件下均质2次。喷雾干燥[22-24]:喷雾干燥的条件为进口温度160℃,出风温度70℃,蠕动泵转速8 r/min。

1.3.2 最佳保护剂的筛选试验

(1)Plackett-Burman试验[25-28]

采用Plackett-Burman试验设计法对发酵核桃粕复合粉中乳酸菌保护剂进行筛选,在单因素预试验基础上,设计因素与水平见表1。进行统计分析选出效果最佳的保护剂进行最陡爬坡试验逼近关键因素的最大响应区域,在此基础上,采用Box-Benhnken试验设计法进行配方优化,得出最佳配比。

表1 Plackett-Burman设计试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design experiments

(2)最陡爬坡试验

通过PB试验结果筛选出对发酵核桃粕复合乳活菌率及感官品质影响显著的因素,依据各因素的效应值选择适当步长,进行最陡爬坡试验。

(3)Box-Behnken试验

由最陡爬坡试验结果,设计Box-Behnken试验,其因素与水平见表2。

表2 Box-Benhnken试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments

1.3.3 感官评定

邀请10名专家及工作人员对发酵核桃乳及发酵核桃粕复合乳的感官评分进行分析,并采用模糊数学评分法[29]对结果进行分析,感官评分标准见表3。

表3 发酵核桃粕复合粉感官评分标准Table 3 Sensory evaluation standards of fermented walnut dregs composite powders

根据感官评定依据表,建立模糊数学模型的因素集、评语集及权重集。其中以口感、色泽、组织状态为因素集U={口感U1,色泽U2,组织状态U3},以好、较好、一般、差为评语集V=｛好,较好,一般,差},而权重集R={R1,R2,R3}={0.4,0.3,0.3},即口感占0.4,色泽占0.3,组织状态占0.3。根据感官评定结果,建立3个单因素评价矩阵,用模糊数学评价方法对其进行分析。对添加各乳酸菌保护剂得到的核桃粕乳样液分别编号后,根据感官评价标准对发酵核桃粕乳的品质要求进行模糊综合评判,建立评判集N=X×R,其中R为权重集,X为模糊矩阵。

1.3.4 综合分值

取试验的考察指标(活菌率M,感官评分N)采用加权综合性评分法进行分析,其各因素隶属函数如下[30]:

综合分值为Yi=a1M1i+a2N2i,式中a1,a2权重系数,其中a1=0.7,a2=0.3。

1.3.5 乳酸活菌率的测定

保温试验法活菌率:取样品乳液在75℃水浴锅中保温25 min后,测其保温前后活菌总数之比；

喷雾干燥法活菌率[31]:喷雾干燥后复原的样品乳液活菌总数与喷雾干燥前样品乳液活菌数之比。

1.3.6 冲调液稳定性

称取样品20g置于250mL量筒中量取80℃水180g倒入烧杯中搅拌,静置3 min,测量上清液高度h1和冲调液总高度h,按公式K=h1/h计算冲调稳定性K值。若K＜0.05,则表明样品的冲调稳定性较好[32]。

1.3.7 分析检测

蛋白质含量测定:参考GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；脂肪含量测定:参考GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》；水分测定:参考GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》；总膳食纤维含量测定:参考GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纤维的测定》；乳酸活菌数的测定:参照GB 4789.35—2010《食品微生物检验乳酸菌检验》；大肠菌群、致病菌检验:参照GB/T 4789.21—2003《食品微生物检验冷冻饮品、饮料检验》。

1.3.8 统计分析

采用PASW Statistics v18、Design expert及Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计最佳保护剂筛选结果

选用试验次数N=12的试验设计,对7个因素进行考查,响应值为活菌率与感官分值的综合分值(Y)。试验设计结果见表4。

表4 Plackett-Burman设计试验结果与分析Table 4 Results and analysis of Plackett-Burman design experiments

表5 偏回归系数及显著性检验结果Table 5 Results of partial regression coefficients and significance tests

通过对表4数据的回归方差分析,结果见表5。由表5可知,该模型显著(P＜0.05),具有统计学意义；判定系数R2=0.931 5,表明93.15%的试验数据可用此模型解释。A、B、C、D、E具有显著负效应,F、G具有显著正效应；这7个保护剂对发酵核桃粕复合乳活菌率及感官分值的影响顺序依次为B＞C＞D＞F＞E＞G＞A；因此试验结果选择脱脂乳粉、海藻糖、麦芽糖为主要影响因素,在后续试验中应当减少脂乳粉、海藻糖、麦芽糖的添加比例。

2.2 最陡爬坡试验结果

结合Plackett-Burman试验结果,选取脱脂乳粉、海藻糖、麦芽糖进行最陡爬坡试验。根据这3因素的效应大小比较,设定它们的变化方向和步长,最陡爬坡试验见表6所示。

表6 最陡爬坡试验设计结果Table 6 Results of the steepest ascent experiments design

由表6可知,2号试验组综合分值最高,即选择脱脂乳粉添加量为2%、海藻糖添加量2%、麦芽糊精添加量3%范围数值进一步进行响应面试验优化。

2.3 Box-Benhnken Design分析法优化工艺

根据最陡爬坡试验结果,设计Box-Benhnken试验,以海藻糖(A)、脱脂乳粉(B)、麦芽糊精(C)为影响因素,综合分值为响应值(Y),试验设计与结果见表7,方差分析结果见表8。

表7 Box-Benhnken试验设计及结果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiments

表8 回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

使用Design experts软件进行多元回归分析,经回归拟合后,试验因子对响应值的回归方程表示为:

由表8可知,以感官分值为响应值时,模型P＜0.0100,表示二次方程模型极显著。同时失拟项P=0.068 1＞0.05,失拟项差异不显著,说明该方程对实验拟合情况好,试验误差小。方程的决定系数为R2=0.999,表明99.9%的数据可用此方程解释。变异系数(coefficient of variation,CV)反映模型的置信度,CV值越低,模型的置信度越高,本实验的CV为0.12%,说明其置信度较高,模型方程能够较好地反映真实的试验值,可用此模型分析响应值的变化。3个因素对综合分值影响的大小依次为脱脂乳粉＞海藻糖＞麦芽糊精。

2.4 响应面交互作用分析与优化

图1 海藻糖、脱脂乳粉与麦芽糊精交互作用对综合分值影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction among trehalose,dried skim milk and maltodextrin on comprehensive score

响应面交互作用分析与优化通过DesignExpert 8.0软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析,绘制响应面曲线见图1。由图1可知,海藻糖对发酵核桃粕复合粉中乳酸菌保护剂综合分值影响最为显著,表现为曲线较陡,海藻糖添加量为2.23%。而脱脂乳粉和麦芽糊精影响次之,表现为曲线较为平缓,其最佳添加量分别为2.5%和2.77%。

由软件分析得到保护剂的最优配方为海藻糖2.23%、脱脂乳粉2.5%、麦芽糊精2.77%；在此最佳条件下,产品综合分值理论上可达0.920。按最优工艺参数进行3次重复验证试验,结果取平均值,得到产品综合分值为0.917,其中乳酸菌存活率为85.1%,感官评分8.1分；与预测值较为接近,表明得到的最优工艺参数准确可靠。

2.5 发酵核桃粕复合粉样品的超微结构

未加保护剂及加保护剂的两种发酵核桃粕复合粉样品放大相同倍数后观察电镜图像,结果如图2所示。

图2 未加保护剂(A)及加保护剂(B)产品的电镜图Fig.2 Electron microscopy figure of products without protective agent(A)and with protective agent(B)

由图2A可知,未添加保护剂产品,复合乳浆黏稠,在喷雾干燥时水分没有很好的蒸发掉,形成了不规则,黏连一起的大颗粒,乳酸菌容易被暴露在外界,降低了产品益生菌的活菌率依据[33]。由图2B可知,添加保护剂样品颗粒规整,呈球状,颗粒表面有微孔,说明在喷雾干燥过程中,保护剂及复合乳浆中的蛋白质,在液滴干燥时,表面形成了致密的膜,随着水分的蒸发,表面蛋白质膜的致密性和刚性程度不断增加,颗粒形成了中空结构；由于颗粒内空体积＞50%,保护剂连同核桃乳浆将乳酸菌包裹在颗粒内部[34]。这样保护剂起到了成膜性能好、防止产品结块,改善产品组织结构等作用,同时使乳酸菌得到了保护。

2.6 发酵核桃粕复合粉指标的测定结果

原料半成品经喷雾干燥后的理化、微生物指标对比,结果见表9。

表9 产品指标检测结果Table 9 Determination results of products indicators

由表9可知,添加保护剂的产品乳酸菌活菌水平得到明显提高,产品乳酸菌活菌数是无保护剂产品的137.9倍,保护剂对提高乳酸菌在加工中的抗逆性具有重要作用；添加保护剂较不添加保护剂产品的水分含量低0.47%,总膳食纤维高1.40%,相关品质有所提升,可见,保护剂不但起到保护活菌作用,同时防止粘黏结粒,改善产品组织状态等。3结论

通过Plackett-Burman试验设计,从谷氨酸钠、脱脂乳粉、海藻糖、麦芽糊精、蔗糖、阿拉伯胶和甘油7相关因子中筛选出对活菌率影响较突出的为:海藻糖、脱脂乳粉、麦芽糊精；其产品综合分值为0.917,其中乳酸菌存活率为85.1%,感官评分8.1；采用Box-Behnken试验设计优化后,保护剂的最优配比为海藻糖2.23%、脱脂乳粉2.5%、麦芽糊精2.77%。最终产品的各项指标为:乳酸菌活菌数9.71×108CFU/g、脂肪8.24%、膳食纤维5.43%、水分2.44%、蛋白质9.74%、大肠菌群≤3 MPN/100 mL、致病菌未检出。

产品较目前蛋白固体饮料相比,原料利用核桃油加工副产物核桃粕、薏米营养保健功能及营养互补性,产品营养构成较好,特别富含活性乳酸菌,更利于健康保健。与传统液态发酵乳品相比,其固态低水分形式利于长期贮运和销售、食用方便,也可作为乳酸菌饮料的发酵剂和制备奶酪、酸奶雪糕的辅助营养原料。

[1]赵见军,张润光,马玉娟,等.核桃粕中蛋白提取工艺的优化[J].食品科学,2014,35(18):40-46.

[2]XIUMING W,HAIXIA C,SHUQIN L,et al.Physico-chemical properties,antioxidant activities and antihypertensive effects of walnut protein and its hydrolysate[J].J Sci Food Agric,2015,7(9):2579-2587.

[3]卢 娣.核桃降压肽的制备及分离纯化研究[D].石河子:石河子大学,2015.

[4]康俊杰,陈树俊,赵瑞欢,等.核桃粕组成测定及抗氧化多肽工艺优化的研究[J].农产品加工·学刊,2014(2):31-34.

[5]ROSENTHAL A,PYLE D L,NIRANJAN K.Aqueous and enzymatic processes for edible oil extraction[J].Enzyme Microb Tech,1996,19:402-420.

[6]SZETAO K W C,SATHE S K.Walnut(Juglans regial):proximate composition,protein solubility,protein amino acid composition and protein in vitrodigestibility[J].Sci Food Agric,2000,80:1393-1401.

[7]郝 剑,张卫民,杨红军,等.核桃粕制备微胶囊速溶核桃粉的工艺研究[J].陕西师范大学学报:自然科学版,2014,42(5):103-108.

[8]徐素云,罗 昱,姚 敏,等.苦荞低脂低糖核桃乳饮料的工艺优化[J].食品与发酵工业,2014,40(7):246-250.

[9]白凤翎,励建荣.抗真菌性乳酸菌生物保护剂的研究进展[J].现代食品科技,2014,30(5):311-319.

[10]YU F,ZHANG J,ZHUO Y,et al.Research and application of adlay in medicinal field[J].Chinese Herbal Med,2017,9(2):126-133.

[11]QU D,SUN W J,LIU M J,et al.Bitargeted microemulsions based on coixseedingredientsforenhancedhepatictumordeliveryandsynergistic therapy[J].Int J Pharm,2016,503(1-2):90-101.

[12]贾青慧,陈 莉,王 珍,等.薏米及薏米糠氨基酸组成分析及营养评价[J].食品工业,2017,38(4):185-188.

[13]潘 杨,刘 军,敬思群.核桃、杏仁蛋白发酵饮料工艺研究[J].中国酿造,2008,27(18):92-95.

[14]魏晓璐,黄 鑫,冯 悦,等.核桃乳(露)饮品中花生、大豆成分的PCR检测方法[J].食品工业科技,2014,35(13):288-291,295.

[15]牛美兰,邢建华,张 强,等.枸杞核桃乳工艺条件与配方[J].湖北农业科学,2012,51(12):2549-2551,2559.

[16]刘瑞芳.核桃蛋白发酵乳的生产工艺研究[D].太原:山西大学,2015.

[17]回瑞华,侯冬岩,郭 华,等.薏米中营养成分的分析[J].食品科学,2005,26(8):375-377.

[18]敬思群,李桂荣,陈晓平.乳酸菌发酵核桃乳工艺及物性学研究[J].中国乳业,2005(4):52-56.

[19]李成涛,吕嘉柄.乳酸菌及其发酵乳制品的发展趋势[J].中国酿造,2005,24(8):12-15.

[20]LINGDREN S E,DOBROGOSZ W J.Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations[J].FEMS Microbiol Rev,1990,87(1-2):149-163.

[21]阎 靳,刘 伟.提高全脂核桃乳稳定性的生产工艺研究[J].中国奶牛,2014(14):37-40.

[22]孙颜君,吕加平,刘振民.不同喷雾干燥温度对乳蛋白浓缩物加工性质的影响[J].食品科技,2014,39(1):42-47.

[23]KEOGH M K,MURRAY C A,KENNEDY B T O.Effects of ultrafiltration of whole milk on some properties of spray-dried milk powders[J].Int Dairy J,2013,13(12):995-1002.

[24]AGUILAR C A,HOLLENDER R,ZIEGLER G R.Sensory characteristics of milk chocolate with lactose from spray-dried milk powder[J].J Food Sci,2015,59(6):1239-1243.

[25]MONTOM E D C.Design and analysis of experiments[M].New York:John Wiley&Sons,1991:35-40.

[26]ROBINSON T J,LARAMIE W Y.The design and analysis of industrial experiments[M].London:Longman Group Limited,1978:45-48.

[27]史亚军,王 媚,吴 星,等.Plackett-Burman设计与星点设计-效应面法优化珠子参皂苷磷脂复合物制备工艺[J].中国药房,2015(4):518-521.

[28]杨冀艳,胡 磊,许 杨,等.Plackett-Burman设计和响应面法优化荷叶总黄酮的提取工艺[J].食品科学,2009,30(6):29-33.

[29]KAACK K,CHRISTENSEN LP,HUGHES M,et al.The relationship between sensory quality and volatile compounds in raw juice processed from elderberries[J].Eur Food Res Technol,2005,221(3-4):244-254.

[30]李 鹏.多指标综合评价的回归评分法[C]//中国航空学会.2015年第二届中国航空科学技术大会论文集,中国航空学会:2015.

[31]周 曼,柳 永,毛争争,等.高活菌率的干酪乳杆菌微胶囊研究[J].浙江农业学报,2014,26(2):461-466.

[32]冯 颖,何 群.喷雾干燥法生产无梗五加果粉工艺[J].江苏农业科学,2016,44(11):329-333.

[33]付 博,马 齐,王卫卫.乳酸双歧杆菌喷雾干燥工艺研究[J].中国乳品工业,2010(5):10-13.

[34]张 煜,孙 波,接伟光.活性乳酸菌豆粉喷雾干燥工艺的优化[J].食品工业科技,2012,33(10):261-267.