UVB对成纤维细胞中IFI16表达的影响

马慧敏 赵 琦 刘 玮

IFI16(interferon inducible protein 16)是干扰素诱导核蛋白。IFI16最初被发现于淋巴细胞核内，后经免疫组化分析发现，IFI16广泛表达于不同组织中[1]，包括血管内皮细胞、成纤维细胞等[2]。Hensler等证实IFI16基因包含在细胞老化中起作用的基因[3]。2010年，有学者发现IFI16可以抑制细胞生长，诱导细胞老化，并下调hTERT的表达[4,5]，由此将干扰素诱导蛋白引入到衰老研究领域。

IF116调节细胞增殖和细胞周期[6]，在老化成纤维细胞中IFI16 mRNA和蛋白水平高于年轻细胞[7]；在正常人前列腺细胞，细胞老化后IFI16表达水平升高；永生化的成纤维细胞中IFI16表达降低，过度表达IFI16可以明显地抑制细胞增殖[8]。在鳞状细胞癌细胞、睾丸癌及人前列腺癌中IFI16表达下调[9-11]。以上的研究结果表明细胞老化的生物学过程中IFI16表达增高且在该过程中发挥重要作用。

β-半乳糖苷酶活性升高是典型的复制老化的生物学标志[12]，细胞生长停滞是细胞老化的另一特征。实验中，以人成纤维细胞为研究对象，使用UVB重复照射细胞，检测β-半乳糖苷酶及细胞周期，以确定细胞老化模型建立，进而检测IFI16 mRNA及蛋白水平变化，以明确IFI16在细胞光老化过程中其表达是否变化。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 DMEM高糖培养液(德国，PAA)，胎牛血清(北京元享圣马生物技术有限公司)，双抗(100 U/mL青霉素及100 ug/ml链霉素)，UVB照射装置(sigma),UVB辐照计(北京师范大学光电仪器厂)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)，酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD)，trizol(invitrogen),cDNA合成试剂盒(北京天根)，real time PCR mix(北京天根)，IFI16单克隆抗体(abcam)。

1.2 细胞培养与UVB照射 常规分离培养人成纤维细胞。取5～10代以内成纤维细胞，按10000个/cm2细胞接种至培养皿中，UVB照射细胞时，将培养皿中的培养液换成PBS,照射完毕后换回培养液。UVB照射剂量为：100、200、 300、400 及 500 mJ/cm2，对照组除不接受UVB照射外，其他处理同UVB照射组细胞。

为了更加准确地模拟光老化的过程，根据UVB对成纤维细胞活性影响的试验结果选择小剂量重复照射方式，以300 mJ/cm2作为照射总剂量，每次100 mJ/cm2，共三次照射。

1.3 细胞增殖率测定 用WST-8分析细胞活性。UVB照射后24 h，用含10% WST-8溶液的新鲜培养液孵育细胞2 h后，用酶标仪于450 nm处测定OD值。

1.4 原位β-半乳糖苷酶染色分析 根据试剂使用说明，用2%甲醛和0.2%戊二醛固定细胞后，PBS冲洗2遍，按说明配制X-gal溶液，于37℃孵育24 h后，观察三个视野，每个视野至少计数100个细胞，并计算染色细胞阳性率。

1.5 细胞周期分析 根据试剂盒(Cycletest plus, BecTon Dickinson, USA)说明行细胞周期分析。收集细胞，用70%酒精于4℃固定过夜后，离心用PBS清洗2次，依次加入A和B溶液于室温下孵育10 min，最后用C溶液于冰上染色10 min；过滤后，上机检测。

1.6 RNA提取及实验定量PCR 用Trizol提取细胞总RNA，取0.5 ug RNA为模板合成cDNA；用1 ul cDNA为模板进行实时定量PCR反应，以β-actin为内参并设阴性对照，每个样本设三个重复。反应条件为：95℃，15 min，热激活；95℃ 15 s 变性，65℃ 1 min退火和延伸，共40个循环。扩增结束时，做熔解曲线。用“△△CT方法”分析表达水平。

IFI16及β-actin引物如下：IFI16 forward (5′-ACTGAGTACAACAAAGCCATTTGA-3′), IFI16 reverse (5′-TTGTGACATTGTCCTGTCCCCAC-3′)， β-actin forward (5′-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3′), β-actin reverse (5′-TGTCCACGTCACACTTCA-3′)。

1.7 Western分析 用RIPA裂解细胞提取蛋白并用BCA做蛋白定量，10% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室湿孵育1 h，ECL发光，压片，分析各条带的灰度，将目的条带的灰度值与内参的灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平。

1.8 统计学方法 结果用mean±S.D.方式表示。根据需要采用t检验或单因素方差分析不同处理组之间的差异，P<0.05被认为有统计学差异。

2 结果

2.1 UVB细胞毒性分析 UVB照射后，在照射剂量为300 mJ/cm2时，细胞活性轻度下降,与对照组无显著差异(P>0.05)；当剂量达到400 mJ/cm2和500 mJ/cm2时，细胞活性下降显著(*P<0.0001)(表1，图1)。

2.2 UVB照射后老化相关β-半乳糖苷酶染色分析 在本研究中，UVB照射后，β-半乳糖苷酶染色阳性率由11%上升为84% (图2)。

2.3 UVB照射后细胞周期分析 UVB照射后，处于G2/M期的细胞比例由9.29%上升到31.16%，与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)(图3)。

2.4 UVB照射细胞后，IFI16表达水平升高 UVB照射后，IFI16 mRNA和蛋白表达水平均上升，分别为2.11±0.45倍和1.59±0.23倍，且升高有统计学意义(均P<0.05)，见图4、5。

表1 紫外线对细胞增殖活性的影响

图1 UVB照射后细胞毒性分析：UVB处理剂量由0～500 mJ/cm2。(*,与对照组相比p<0.05)图2 三次小剂量UVB(100 mJ/cm2)重复照射后β-gal活性分析：(2a)对照组(β-gal染色,×200)，(2b)UVB处理组细胞(β-gal染色,×200)

图3 三次小剂量UVB(100 mJ/cm2)重复照射后细胞周期分析：(a)对照组细胞周期分布；(b)UVB处理组细胞周期分布；(c)细胞周期百分比条图；(d)两组细胞处于细胞周期G2/M期百分比分析(*,与对照组相比P<0.05)

图4 三次小剂量UVB(100 mJ/cm2)重复照射后，IFI16 mRNA表达水平的变化(*P<0.05)图5 a、b三次小剂量UVB(100 mJ/cm2)重复照射后，IFI16蛋白表达水平变化

3 讨论

目前，光老化机制的研究是学者关注的热点问题，对该问题的研究可以预防紫外线引起的损害。为了研究这一机制，细胞光老化模型的建立是尤为关键的步骤。

首先，根据UVB对成纤维细胞的光毒性作用，选择小剂量重复照射的方式作用于成纤维细胞。有研究认为，当β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例达到55%时，细胞即进入老化阶段[13]。在本研究中，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数达到84%，因此，符合细胞老化的标准。细胞周期停滞是老化细胞的另一特征。UVB照射后，细胞周期停滞于G2/M期，这与以前的研究相一致，即老化细胞的细胞周期停滞于G2/M[14]期。以上实验结果证实，UVB小剂量重复照射的方式可以在短时间内建立稳定的细胞老化模型。

在近期研究中，证实IFI16参与自然老化过程，在该过程中，IFI16表达升高，且转录性调节P53及端粒酶而介导细胞老化过程[15，16]。在本研究中，UVB照射后诱导细胞老化，在该老化细胞中，IFI16 mRNA及蛋白表达均升高。但是，在细胞光老化过程中，IFI16表达升高能否调节P53及端粒酶，并进而影响细胞光老化进程中的生物学行为，仍然需要进一步研究。

[1] Gariglio M, Azzimonti B, Pagano M, et al. Immunohistochemical expression analysis of the human interferon-inducible gene IFI16, a member of the HIN200 family, not restricted to hematopoietic cells[J]. J Interferon Cytokine Res, 2002, 22(7):815-821.

[2] Dawson MJ, Elwood NJ, Johnstone RW, et al. The IFN-inducible nucleoprotein IFI 16 is expressed in cells of the monocyte lineage, but is rapidly and markedly down-regulated in other myeloid precursor populations[J]. J Leukoc Biol,1998,64(4):546-554.

[3] Hensler PJ, Annab LA, Barrett JC, et al. A gene involved in control of human cellular senescence on human chromosome 1q[J]. Mol Cell Biol,1994,14(4):2291-2297.

[4] Liao JC, Lam R, Brazda V, et al. Interferon-inducible protein 16: insight into the interaction with tumor suppressor p53[J]. Structure,2011,19(3):418-429.

[5] Song LL, Ponomareva L, Shen H, et al. Interferon-inducible IFI16, a negative regulator of cell growth, down-regulates expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene[J]. PLoS One,2010,5(1):e8569.

[6] Galatro TF, Holtman IR, Lerario AM, et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes[J]. Nat Neurosci,2017,20(8):1162-1171.

[7] Xin H, Pereira-Smith OM, Choubey D. Role of IFI 16 in cellular senescence of human fibroblasts[J]. Oncogene,2004,23(37):6209-6217.

[8] Clarke CJ, Hii LL, Bolden JE, et al. Inducible activation of IFI 16 results in suppression of telomerase activity, growth suppression and induction of cellular senescence[J]. J Cell Biochem,2010,109(1):103-112.

[9] Almstrup K, Leffers H, Lothe RA, et al. Improved gene expression signature of testicular carcinoma in situ[J]. Int J Androl,2007,30(4):292-302; discussion 303.

[10] Alimirah F, Chen J, Davis FJ, et al. IFI16 in human prostate cancer[J]. Mol Cancer Res,2007,5(3):251-259.

[11] Mazibrada J, De Andrea M, Rittà M, et al. In vivo growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma by the Interferon-inducible gene IFI16[J]. Cancer Lett,2010,287(1):33-43.

[12] Dimri GP, Lee X, Basile G, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(20):9363-9367.

[13] Maier AB, Westendorp RG, VAN Heemst D. Beta-galactosidase activity as a biomarker of replicative senescence during the course of human fibroblast cultures[J]. Ann N Y Acad Sci,2007,1100:323-332.

[14] Ma W, Hommel C, Brenneisen P, et al. Long-term growth arrest of PUVA-treated fibroblasts in G2/M in the absence of p16(INK4a) p21(CIP1) or p53[J]. Exp Dermatol,2003,12(5):629-637.

[15] Kwak JC, Ongusaha PP, Ouchi T, et al. IFI16 as a negative regulator in the regulation of p53 and p21(Waf1)[J]. J Biol Chem,2003,278(42):40899-40904.

[16] Choubey D, Panchanathan R. IFI16, an amplifier of DNA-damage response: Role in cellular senescence and aging-associated inflammatory diseases[J]. Ageing Res Rev,2016,28:27-36.