高血压患者RYR-3基因多态性与大动脉粥样硬化性卒中的相关性研究

陈颖聪，钱安民，张建军，张志军，薛常虎，艾妮

既往研究已发现Ca2+同高血压密切相关，并可通过给予钙离子拮抗剂行降血压治疗[1,2]。有研究发现Ca2+可能还参与血管内皮细胞的炎症、增殖、分化和氧化应激等，是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）发生发展的重要影响因素[3,4]。兰尼碱受体-3（ryanodine receptor 3，RYR-3）是体内调控Ca2+浓度的主要受体之一，其基因多态性可能与AS相关[5]。本研究对高血压人群中RYR-3基因多态性与大动脉粥样硬化性卒中（Large Artery Atherosclerosis，LAA）的相关性进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月至2015年12月我科治疗的高血压合并LAA患者232例为卒中组，入组标准：年龄45～80岁，出生并长期生活于陕西的汉族人；高血压诊断符合2010年《中国高血压防治指南》诊断标 准[6]；经头颅CT和（或）MR检查确诊为缺血性卒中，且LAA诊断符合TOAST（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment）分型标准[7]。排除标准：其他类型的缺血性卒中；肝、肾等重要脏器合并严重器质性病变或功能障碍；合并颅内或全身感染；恶性肿瘤；精神病、有意识障碍。参照卒中组的年龄和性别构成，选择同期在我院治疗的患有高血压非卒中，且不伴颈部血管狭窄的患者200例为高血压组，高血压诊断符合2010年《中国高血压防治指南》诊断标准；采用颈部血管超声进行评价有无颈部血管狭窄，将中膜厚度≥1.5 mm判定为血管狭窄。另选择同期于我院体检中心接受体检的非高血压健康体检者200例为对照组。本研究通过本院伦理委员会审核批准，受试者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 收集临床指标 包括患者年龄、性别、吸烟史、体重指数（body weight index，BWI）、糖尿病、血脂异常患病情况，及血糖、血脂等生化指标。糖尿病诊断和分类按照2010年《中国2型糖尿病防治指南》的诊断标准[8]；血脂异常诊断符合以下标准之一或多条：甘油三酯（triglyceride，TG）≥1.7 mmol/L，总胆固醇（total cholesterol，TC）≥5.18 mmol/L，低密度脂蛋白胆固 醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）≥ 3.37mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）≤1.04 mmol/L；吸烟定义为平均每天≥1支，至少持续3月。

1.2.2 基因多态性检测 采集所有受试者清晨空腹时外周静脉血2 mL，按照氯仿饱和酚法提取基因组DNA。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检测RYR-3基因rs877087和rs2229116多态性。PCR反应体系包括：10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL（上游引物：5’-dAAGAGGAAGAAGCGATGGT-3’，下游引物：5’-dCAGATGAAGCATTTGGTCTCCAT-3’），dNTP 混合物 2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.25 μL，模板DNA1 μL，不足部分由灭菌蒸馏水补足。反应条件为95℃预变性 4 min，然后按照 95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72℃30 s顺序循环30周期，最后72℃延长3 min。加入虾碱性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）反应液，按37℃40 min、85℃5 min进行反应。延伸反应体系包括：延伸引物0.2 μL，去离子水0.6 μL，iplex缓冲液0.2 μL，iplex酶0.4 μL，反应条件：94 ℃ 30 s；56 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，5个循环；按照该顺序循环40周期，72 ℃再延长3 min。将样本置于质谱仪中检测，采用TYPER软件分析结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件分析数据，计量资料均服从正态分布，结果以（±s）表示，2组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料结果以构成百分比（%）表示，χ2检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验；采用多因素Logistic回归分析法评价各因素与缺血性卒中间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组临床资料比较

卒中组232例，男146例，女86例；年龄（57.6±7.2）岁；BWI（22.5±3.6）kg/m2；吸烟108例（46.6%）；糖尿病64例（27.6%），血脂异常156例（67.2%）；收缩压（systolic blood pressure，SBP）（138.5±18.2）mmHg，舒张压（diastolic blood pressure，DBP）（88.4±11.0）mmHg；TG（1.5±0.5）mmol/L，TC（4.6±1.9）mmol/L，LDL-C（2.9±0.9）mmol/L，HDL-C（1.2±0.3）mmol/L；空腹血糖（5.4±1.4）mmol/L。高血压组200例，男123例，女77例；年龄（56.7±7.3）岁；BWI（22.7±3.8）kg/m2；吸烟 62例（31.0%）；糖尿病26例（13.0%），血脂异常118例（56.0%）；SBP（139.0±19.3）mmHg，DBP（88.7±11.9）mmHg；TG（1.5±0.6）mmol/L，TC（4.2±2.0）mmol/L，LDL-C（2.7±0.9）mmol/L，HDL-C（1.2±0.3）mmol/L；空腹血糖（5.1±1.2）mmol/L。对照组200例，男118例，女82例；年龄（56.5±7.1）岁；BWI（23.1±3.4）kg/m2；吸烟59例（29.5%）；糖尿病28例（14.0%），血脂异常108例（54.0%）；SBP（120.4±14.2）mmHg，DBP（78.2±10.3）mmHg；TG（1.4±0.5）mmol/L，TC（4.1±2.1）mmol/L，LDL-C（2.6±0.8）mmol/L，HDL-C（1.2±0.2）mmol/L；空腹血糖（5.0±1.3）mmol/L。3组年龄、性别、BWI、TG、HDL-C等差异无统计学意义（均P＞0.05）。卒中组吸烟、糖尿病、血脂异常、TC、LDL-C及空腹血糖均高于高血压组和对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。卒中组和高血压组入院基线SBP和DBP均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），卒中组与高血压组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 基因型和等位基因分布

RYR-3基因rs877087位点基因型包括TT、CT和CC三种，等位基因包括T和C两种，卒中组的基因型和等位基因与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；高血压组与对照组，高血压组与卒中组比较，基因型和等位基因的差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。RYR-3基因rs2229116位点基因型包括AA、AG和GG三种，等位基因包括A和G两种，高血压组的基因型和等位基因与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；卒中组的基因型和等位基因与高血压组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.3 多因素Logistic回归分析

对于高血压患者，吸烟、糖尿病、RYR-3基因rs2229116位点AA基因型均是发生大动脉粥样硬化性卒中的危险因素，见表2、表3。

表1 基因型和等位基因分布[例(%)]

表2 变量的赋值

表3 多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

AS作为缺血性卒中发病的重要病理基础，一直都是心脑血管疾病的研究热点[9]。目前学者多认为AS是内在基因和外在环境共同作用的结果，Ca2+作为联系细胞内外反应的重要细胞信使，近年来，相继有研究发现Ca2+可能与AS发生发展密切相关，其可能的机制在于：Ca2+作为重要的细胞信号通路信使，直接参与AS相关基因的表达和调控；Ca2+参与多种物质代谢，可间接参与AS形成；细胞内Ca2+浓度变化与炎症发生相关，AS作为一种慢性炎症反应，两者之间也存在联系；Ca2+可参与巨噬细胞凋亡过程，可能与AS斑块破裂相关[3,4,10-13]。

RYRs主要位于肌浆网和内质网上，参与细胞内Ca2+浓度调节，在哺乳动物体内，RYRs包含RYR-1、RYR-2和RYR-3三种类型，其中RYR-1主要分布于骨骼肌，RYR-2主要位于心肌，RYR-3主要存在血管内皮细胞和多种神经结构组织中[5]。最早有研究发现RYR-3基因多态性可能与阿尔兹海默病及乳腺癌相关，近年来，国内外相继有研究发现RYR-3基因多态性可能还与AS形成相关[5,14-16]。目前研究发现RYR-3基因存在多个突变位点，包括rs877087、rs2229116、rs2132207、rs658750、rs2077268和rs4780144等，一项纳入1 262例日本人群的研究发现rs877087和rs2229116基因多态性与AS相关[5]。还有研究发现艾滋病患者中RYR-3基因多态性与颈动脉内中膜厚度相关[15]。吴资波等[17]研究发现RYR-3基因rs877087、rs2229116和rs2132207三个位点多态性均与脑卒中发生无明显联系。笔者总结既往多项研究认为这种结果不一致的原因首先在于各研究的研究对象无严格统一的纳入和排除标准。本研究在前期设计阶段认为既然长久以来大多数研究证实Ca2+在高血压的发生发展中起重要作用，那么，为排除与之相关的偏倚，本研究以高血压患者作为研究人群，探讨该人群中RYR-3基因rs877087、rs2229116位点多态性与LAA的相关性。

本研究显示RYR-3基因rs877087位点基因型和等位基因，仅在卒中组和对照组间差异有统计学意义，卒中组的基因型TT和等位基因T的频率高于对照组，提示rs877087位点T＞C突变可能影响RYR-3稳定及对低Ca2+的调控，进而影响AS的发生发展，但在高血压组和对照组间差异无统计学意义，可能有两种原因：RYR-3基因rs877087多态性与高血压发生无关；两者相关，但由于本研究样本量不足，检验效能低，而导致未发现两者联系。本研究显示关于rs2229116位点的基因多态性，高血压组与对照组比较，卒中组与高血压组比较，差异均有统计学意义，提示rs2229116位点多态性与高血压及AS发生发展可能相关。本研究显示RYR-3基因rs2229116位点基因型AA是高血压患者发生LAA的危险因素。另外，本研究还提示吸烟和2型糖尿病是高血压患者发生LAA的独立危险因素，再次强调戒烟和控制血糖对缺血性卒中防治的意义。

综上所述，本研究发现高血压患者RYR-3基因rs2229116多态性与LAA相关，提示对于高血压患者，如基因检测发现RYR-3基因rs2229116位点基因型为AA，合理应用钙离子拮抗剂降压可能有助于LAA预防。当然，目前研究发现缺血性卒中可能与多基因共同表达相关，RYR-3基因与其他基因相互作用的具体机制有待进一步研究。

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