芒果苷通过抑制氧化应激及抗凋亡作用保护大鼠颅脑损伤

谭支强

创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury，TBI）的发生率逐年增加，已成为神经外科常见的疾病之一[1]。TBI后颅内继发水肿、氧化应激反应和炎症反应等是患者死亡的主要原因[2,3]。因此，抑制颅内水肿及氧化应激以及抗神经凋亡能加速TBI患者恢复。芒果苷（Mangiferin，MAN）是一类双苯吡酮类黄酮类化合物，具有抗糖尿病、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[4,5]。本实验探讨MAN对大鼠TBI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量200～250 g，由上海交通大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 Freeny's自由落体架由上海交通大学动物实验中心提供，MAN（纯度≥98%，购于美国Sigma公司）；大鼠丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）Elisa试剂盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）（购于上海博谷公司）；大鼠Bax，Bcl-2一抗，DAB显色试剂盒（购于美国Santa Cruz公司）；1%戊巴比妥钠（购于北京化学试剂公司）；紫外分光光度计（购于美国Bausch Lomb公司）；0.9%氯化钠注射液（购于北京双鹤药业）；注射用青霉素钠（购于瑞阳制药公司）；Image Pro Plus 6.0软件（美国Media Cybernetics公司）。

1.2 方法

1.2.1 TBI模型的制作 术前禁食8 h，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定于Freeny's支架上，消毒，切开颅顶部皮肤后剥离骨膜，充分暴露颅骨，利用微型电钻切开直径约5 mm的圆形骨窗，将50 g打击器置于20 cm高度自由落下撞击骨窗，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。术后大鼠单笼饲养。神经功能缺损评分＞2分表明造模成功。假手术组只制作骨窗，不打击颅脑。

1.2.2 实验分组及给药 60只SD大鼠适应性喂养1周后随机分为5组：假手术组、模型组、MAN低浓度组（10 mg/kg）、MAN中浓度组（20 mg/kg）和MAN高浓度组（40 mg/kg），每组12只。MAN低、中、高组每日通过腹腔注射MAN 1次，连续注射7 d。假手术组和模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。

1.2.3 神经功能评估 采用改良神经功能缺损评分（modified Neurological Severity Score，mNSS）[6]评估术后各组大鼠3 d和7 d的神经功能缺损情况，包括：肢体运动测试6分，感觉测试2分，平衡木测试6分，反射反应及异常活动4分。

1.2.4 颅内水肿的测定 造模7 d后，各组取4只大鼠，取出脑组织后称重，随后放入80℃烘箱中放置72 h，待完全风干后再次称重。

1.2.5 Elisa法检测损伤脑组织氧化应激因子含量及活性 造模7 d后，各组取4只大鼠脑组织，保留损伤灶及边缘2 mm区域，每个脑组织切分为2份，分别用于氧化应激因子和Bax/Bcl-2蛋白的检测。充分剪碎后研磨，利用标准稀释液进行稀释，加终止液后混匀，测定450 nm吸光度，根据吸光度计算MDA、CAT、SOD、GSH含量。

1.2.6 Western-blot法检测Bax和Bcl-2蛋白表达造模7 d后，取出损伤区域脑组织，充分剪碎后研成匀浆，3 mL/g蛋白裂解液充分裂解后，以10 000 g离心30 min，取出上清液。BCA法测定总蛋白浓度。经过加样、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗（1:1 500）孵育过夜，二抗（中衫金桥）1∶5 000孵育3 h，脱脂奶粉充分洗净后加入显色剂显色，利用凝胶成像系统成像，Image Pro Plus 6.0软件计算各组条带灰度值。1.2.7免疫组织化学染色观测 造模7 d后，各组取4只大鼠脑组织，保留损伤灶及边缘2 mm区域，10%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，从损伤部位的脑组织连续切片，片厚5 μm。切片后行Caspase-3免疫组织化学染色，荧光倒置显微镜下观察，Caspase-3阳性镜下可呈黄色或棕黄色，形态不规则。200倍镜视野下，每张切片随机取3个视野，观察Caspase-3染色及利用Image Pro Plus 6.0软件检测Caspase-3蛋白表达平均光密度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能比较

造模后3 d和7 d，mNSS评分明显升高（P＜0.05），经过芒果苷治疗后，MAN 3个浓度组mNSS评分低于假手术组（P＜0.05）；MAN中浓度组低于低浓度组，高浓度组低于低、中浓度组，呈剂量依赖趋势（P＜0.05），见表1。

表1 各组造模后mNSS评分比较（±s，n=12）

表1 各组造模后mNSS评分比较（±s，n=12）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与MAN低浓度组比较，③P＜0.05；与MAN中浓度组比较，④P＜0.05

7 d 0 8.7±0.8①7.2±0.9②6.4±0.7②③5.5±0.6②③④19.343 0.007组别假手术组模型组MAN低浓度组MAN中浓度组MAN高浓度组F值P值只数12 12 12 12 12 3 d 0 12.1±1.3①9.5±0.9②8.6±0.7②③7.3±0.8②③④14.862 0.018

2.2 芒果苷对TBI大鼠脑水肿情况的影响

假手术组、模型组、MAN低浓度组、MAN中浓度组、MAN高浓度组的脑组织含水量分别为（68.3±4.4）%、（82.1±4.9）%、（79.2±4.7）%、（74.8±4.4）%、（70.4±4.8）%，模型组的脑组织含水量较假手术组明显升高（P＜0.05）。MAN低浓度组和中浓度组的脑组织含水量较模型组降低（P＜0.05），而高浓度组脑含水量明显低于低、中浓度组脑组织含水量（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠MDA、CAT、SOD及GSH活性比较

造模后，模型组MDA含量明显升高，CAT、SOD、GSH含量明显降低（P＜0.05），经MAN治疗后，各组氧化应激因子明显逆转（P＜0.05），中浓度组高于低浓度组，高浓度组高于低、中浓度组，呈剂量依赖趋势（F=10.967，17.455，9.174，13.021，P＜0.05），见表2。

2.4 Western blot法检测Bax/Bcl-2蛋白表达

各组大鼠脑组织Bax蛋白表达分别为（1.1±0.2）、（11.8±0.9）、（9.1±0.8）、（7.3±0.8）、（5.6±0.7），模型组中凋亡蛋白Bax表达提高（P＜0.05），而经过MAN治疗后，损伤脑组织中Bax表达得到明显抑制，与模型组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），各浓度组之间，中浓度组低于低浓度组，而高浓度组低于低、中浓度组（F=16.927，P＜0.05）；各组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达分别为（9.3±0.9）、（1.0±0.2）、（3.2±0.3）、（3.9±0.4）、（5.7±0.6），模型组中Bcl-2表达明显下调（P＜0.05），而经过MAN治疗后，损伤脑组织中Bcl-2表达得到明显提升（P＜0.05），各浓度组之间，中浓度组高于低浓度组，而高浓度组高于低、中浓度组（F=12.852，P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠Bax及Bcl-2蛋白表达

2.5 免疫组织化学染色观察

各组Caspase-3蛋白均表达于脑皮质，假手术组可见少量Caspase-3表达，模型组可见大量Caspase-3蛋白，MAN组Caspase-3蛋白依次减少，见图2。假手术组、模型组、MAN低浓度组、MAN中浓度组和MAN高浓度组的Caspase-3表达平均光密度分别为（13.9±2.8）、（94.7±9.6）、（82.1±8.8）、（67.9±7.1）、（55.4±6.3），模型组的Caspase-3表达高于假手术组（P＜0.05）。MAN组Caspase-3表达均低于模型组（P＜0.05）。MAN各组之间，中浓度组低于低浓度组，高浓度组低于低、中浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组氧化应激因子表达（±s）

表2 各组氧化应激因子表达（±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与MAN低浓度组比较，③P＜0.05；与MAN中浓度组比较，④P＜0.05

组别假手术组模型组MAN低浓度组MAN中浓度组MAN高浓度组F值P值只数4 4 4 4 4 MDA/(nmol/mg)16.7±1.8 43.8±2.1①31.4±2.2②22.3±1.8②③19.7±1.9②③④10.967 0.029 CAT/(U/mg)183.9±11.4 37.8±10.1①79.8±9.7②99.1±11.2②③141±12.6②③④17.455 0.003 SOD/(U/mg)18.9±1.5 4.1±1.3①6.4±1.4②7.5±1.6②③9.9±1.5②③④9.174 0.014 GSH/(U/mg)42.8±1.9 8.9±1.7①14.8±1.9②21.6±1.9②③31.4±2.1②③④13.021 0.008

3 讨论

TBI包括原发脑损伤（Primary Brain Injury，PBI）和继发脑损伤（Secondary Brain Injury，SBI）[7]，PBI后颅内发生一系列病理生理改变，如脑组织水肿、氧化应激及炎性因子代谢异常或神经细胞凋亡和坏死等[8]。大量研究证明，脑水肿、氧化应激反应、炎性反应以及神经凋亡是TBI后继发性脑损伤的主要原因[9]。

颅内水肿在TBI病情发展中占据重要作用[10]，TBI后血脑屏障发生变化，脑微循环障碍，引起损伤区及周围组织含水量增加，且TBI后可发生脑自由基、前列腺素及神经肽类变化，均可引起脑水肿。本研究通过Feeney氏自由落体法制作的TBI模型，通过干湿法可测量脑水肿情况发现，TBI后脑水肿明显加剧，而经过MAN治疗后，水肿指数明显下调，mNSS评分显示大鼠神经功能明显提高，提示MAN可通过抑制损伤脑组织水肿从而发挥神经保护作用。

图2 各组大鼠Caspase-3表达（免疫组织化学染色×200）

氧化应激是TBI后形成继发性损伤的重要因素之一[11]，TBI后颅内氧自由基大量增加，自由基破坏生物膜结构的完整性和通透性，使细胞钙通道开发，大量钙离子进入细胞内，导致细胞变性、凋亡和坏死。MDA是膜脂过氧化终产物，可直接反映体内膜脂过氧化程度，其含量可间接反映呼吸链酶对细胞的攻击程度[12]。SOD催化过氧阴离子的歧化反应，是细胞内主要的自由基清除剂，广泛存在于哺乳动物细胞内，SOD含量可反映机体细胞内源性氧自由基清除能力[13]。CAT科催化分解过氧化氢，避免过氧化氢与氧在铁螯合物作用下生产有害的氢氧根离子，CAT主要存在于红细胞和机体某些组织内，是过氧化物酶体的标志酶。GSH是一种重要的过氧化物分解酶，可将过氧化物还原成无毒性的羟基化合物，其含量高低可间接反映机体清除过氧化物的能力[14]。本研究发现，TBI后脑组织氧化应激因子MDA明显上调，而CAT、SOD、GSH含量得到抑制，经MAN治疗后，MDA含量明显下调，CAT、SOD、GSH含量明显提高，提示MAN可通过抑制MDA，上调CAT、SOD、GSH含量抑制氧化应激反应，从而发挥神经保护作用。

凋亡是细胞的自毁机制，在TBI后病理生理机制中发挥重要作用，TBI后神经细胞受到氧化应激及炎性因子刺激，启动一系列控制程序，其中Bcl家族与凋亡的关系最为密切。Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，能掌控细胞存活的分子调控点，能通过线粒体膜抑制一些凋亡诱导因子，如Caspase和细胞色素C的释放，促使细胞存活[15]。Bax是细胞内主要的促凋亡因子之一，Bax过表达可拮抗Bcl-2，从而促进细胞凋亡[16]，病理条件下，Bax可促进细胞色素C释放，激活Caspase，加速细胞凋亡。因此，Bax大量表达可能是导致颅脑损伤后神经细胞凋亡的主要原因。目前研究认为，Bcl-2和Bax对细胞凋亡调控作用相互拮抗，存在动态平衡，当Bax过表达，细胞出现凋亡[17-19]。本研究发现，TBI后，脑组织Bax表达水平提高，Bcl-2表达明显下调，而经MAN治疗后Bax蛋白表达受到明显抑制，Bcl-2水平提高，并且，MAN可明显抑制TBI大鼠脑组织Capase-3表达，提示MAN可通过抑制Bax/Bcl-2和Caspase-3途径发挥神经保护作用。

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