神经炎症和自噬在脑损伤中的作用

徐 雪, 张思然, 赵建波, 王艳芳, 张丽慧

(1. 杭州师范大学医学院 药理学教研室，医学神经生物学市级重点实验室，浙江 杭州 310036；2. 浙江医院 神经内科，浙江 杭州 310013)

小胶质细胞是脑内重要的神经免疫细胞，维持神经元微环境的动态平衡，参与脑组织多种生理及病理过程。自噬指真核细胞通过溶酶体降解细胞内受损、变性和衰老的蛋白质和细胞器，实现细胞稳态以及自身物质代谢更新和循环再利用的重要调控机制。最近研究表明，自噬异常诱导小胶质激活及其神经炎症反应在中枢神经系统疾病的发病机制中起关键作用[1-2]。本文主要介绍当前神经炎症与脑损伤的关系以及自噬参与脑损伤后炎症反应的研究进展，在此基础上，进一步讨论自噬对炎症反应的调节作用及机制。

1 神经炎症与脑损伤

神经炎症反应是脑缺血损伤以及帕金森病(Parkinson’s disease, PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD) 等中枢退行性疾病发生发展的关键因素。大鼠局灶性脑缺血以及体外缺糖缺氧诱导的缺血样损伤研究表明，小胶质细胞激活及炎症反应在缺血性脑损伤及神经元死亡中起重要作用[3-4]。PD和AD研究显示，脑内小胶质细胞大量激活，脑组织和脑脊液中炎症细胞因子(包括IL-1β、IL-6 和TNF-α)明显增高并与疾病进展相关[5]。在PD小鼠模型，PD 神经毒素l-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4- phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine, MPTP)诱导黑质纹状体小胶质细胞炎症激活与多巴胺(dopamine, DA)神经元变性死亡一致[6]。在体外细胞培养，1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)激活的小胶质细胞释放前炎症细胞因子和氧化应激产物进一步促进神经元损伤[7]。在AD研究的多种动物模型中，表达突变的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因和早老素1(presenilin-1, PS1)基因的双转基因小鼠能较好地模拟人类AD患者脑内病理改变，是AD研究的重要动物模型[8]。应用APP/PS1小鼠研究发现，皮层小胶质细胞激活及炎症基因IL-1β、IL-6 和NLRP3表达水平与AD样病理和认知障碍密切相关[8]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是经典的小胶质细胞激活剂，黑质注射LPS刺激小胶质细胞激活及DA 神经元变性死亡[9]。LPS 还诱导原代小胶质细胞和小鼠BV2小胶质细胞激活并释放炎症介质TNF-α、IL-1β，IL-6和活性氧(reactive oxygen species，ROS)；LPS 处理的BV2小胶质细胞条件培养液促进培养的PC12神经元死亡[9-10]。因此，充分理解脑损伤发病过程中小胶质细胞介导的神经炎症的作用，可能为防止脑损伤的进行性发展提供潜在靶点。

2 自噬异常参与脑损伤后炎症反应

自噬是继细胞凋亡之后当前神经科学研究的热点和前沿领域之一。根据底物的种类、转运方式以及调控机制的不同，细胞自噬主要分为三种类型：分子伴侣介导的自噬，微自噬和巨自噬。目前，对自噬的研究主要集中在巨自噬即通常所称的自噬。细胞自噬发生过程主要包括吞噬泡(phagophore)的形成，自噬体(autophagosome)的形成，后者与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，并进一步通过溶酶体内的酶降解底物[11]。自噬调节信号的改变有助于自噬活性的检测。自噬相关蛋白Beclin1和LC3II表达增加提示自噬活化[12]，另一方面，自噬底物p62/SQSTM1(以下简称p62)蛋白水平升高通常被认为是自噬活性受抑制的标志[12]。正常生理状态下细胞自噬维持在一定的基础水平，自噬异常(自噬过度活化或不足)在中枢疾病的发病过程中具有重要作用。

已有研究报告，自噬参与脑缺血和中枢退行性疾病的神经炎症过程[13-14]。在小鼠永久性大脑中动脉结扎模型，脑组织缺血缺氧诱导小胶质细胞自噬和前炎症细胞因子TNF-α, IL-1β和 IL-6增加。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤通过抑制自噬，预防缺血后的炎症反应，减轻脑梗死、脑水肿和神经功能障碍[13]。但是，相反的研究结果表明，自噬激活能减轻脑缺血后炎症反应。在整体动物实验，糖原合成激酶3β抑制剂SB216763通过诱导LC3II水平上调，减少永久性局灶性脑缺血大鼠皮层IL-1β，TNF-α和诱导型一氧化氮合酶水平。在培养的原代小胶质细胞，SB216763也增加小胶质细胞自噬活性，抑制炎症反应；应用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术诱导自噬标志蛋白Beclin1基因沉默，减弱SB216763在小胶质细胞的抗炎效应[14]。虽然仍不清楚自噬对小胶质细胞炎症是正性或负性调节，上述结果提示自噬是调控脑缺血后小胶质细胞激活和炎症效应的重要因素[1]。在SD大鼠PD实验研究中，黑质注射PD神经毒素MPP诱导α-突触核蛋白聚集、小胶质细胞激活及小胶质CASP1/IL-1β表达，抗炎药物黄芩苷增加LC3II水平，抑制MPP诱导的上述效应[15]。另一个小鼠的PD研究也表明，降血糖药二甲双胍通过诱导自噬活化(增加LC3Ⅱ和减少p62)，抑制小胶质细胞过度激活上调的NLRP3炎症小体和前炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，增加抗炎细胞因子IL-10水平，减轻MPTP加丙磺舒诱导的DA神经元损伤和运动障碍[16]。在自噬相关基因(autophagy-related gene 7, Atg7)条件敲除小鼠和LC3或Atg 7基因沉默的小胶质细胞，AD神经毒素Aβ诱导小胶质细胞激活、CASP1表达和IL-1β释放增加；以Aβ处理LC3基因沉默小胶质细胞的条件培养液培养神经元，促进神经元损伤；而药物激活自噬可有效预防小胶质细胞炎症和小胶质细胞介导的神经毒性[17]。这些结果提示，自噬异常参与中枢疾病的神经炎症病理过程，调控小胶质细胞自噬水平对炎症相关的中枢神经系统疾病的防治具有重要意义。此外，细胞自噬是一个连续的高度动态变化的生物过程，自噬标志蛋白LC3Ⅱ增加可能是由于自噬活化早期自噬体形成增多，也可能是自噬后期自噬体与溶酶体融合障碍导致自噬体堆积的结果。自噬过程中任一环节的障碍将无法完成其生物学功能。因此，在自噬实验中，应用自噬流检测技术以准确评估细胞自噬活性变化，可进一步阐明自噬在脑损伤炎症中的作用[12]。

3 自噬对炎症反应的调节机制

近年研究发现，自噬与LPS诱导的小胶质细胞炎症激活存在复杂的关系。在LPS诱导的B6C3F1小鼠慢性炎症模型，皮层和海马炎症细胞因子IL-1β增加，伴有自噬标志蛋白Beclin 1、p62和LC3改变[18]。在C57BL/6小鼠，LPS腹腔注射诱导脑内p62持续堆积，LC3早期增加后期下降[19]。在体外研究，LPS处理的BV2细胞时间依赖性的增加聚集体样LC3阳性斑点表达不被经典的自噬抑制剂渥曼青霉素和Atg5 siRNA所抑制；在LPS和经典的自噬诱导剂雷帕霉素共处理细胞，两者独立增加GFP-LC3标志点，Atg5 siRNA抑制雷帕霉素诱导的细胞自噬，但不抑制LPS的作用[20]。这些结果提示，LPS诱导BV2细胞非经典型LC3阳性斑点[20]。LPS在BV2细胞诱导的聚集体样LC3阳性斑点可能类似于巨噬细胞的聚集体样诱导结构(aggresome-like induced structures, ALIS)[21]及树状突细胞ALIS[22]。在巨噬细胞的研究已经证明，LPS通过激活Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)诱导p62依赖性ALIS选择性自噬[21,23]。与巨噬细胞ALIS形成相似，LPS也增加BV2细胞p62表达[20-21]。最近的两个研究发现，LPS诱导BV2细胞NLRP3炎症小体激活和IL1-β增加，伴有自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1增加和大量聚集的p62水平，提示自噬溶酶体降解功能障碍可能是炎症细胞因子产生和释放的原因。自噬抑制剂巴佛洛霉素A1和Atg5 siRNA不抑制LPS诱导的炎症效应[24-25]。应用mRFP-GFP-LC3检测细胞自噬流发现，LPS增加黄色自噬体和红色自噬溶酶体数量，而α7-烟碱乙酰胆碱受体激动剂PNU282987促进自噬体向自噬溶酶体转变，诱导高水平的自噬流。巴佛洛霉素A1或Atg5 siRNA阻断自噬，抑制PNU282987在LPS刺激的BV2细胞的抗炎作用[25]。进一步研究显示，mTOR依赖性自噬诱导剂雷帕霉素和非mTOR依赖性自噬诱导剂海藻糖诱导BV2细胞自噬活化，抑制LPS诱导BV2小胶质前炎症细胞因子IL1-β , IL-6, TNFα和氧化应激产物水平，减少细胞死亡；相反，Atg5 siRNA和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，促进LPS诱导的小胶质细胞激活和炎症效应[20,26]。上述结果表明，LPS诱导小胶质细胞炎症激活和非经典型LC3阳性斑点，药物和基因沉默方法抑制经典型自噬不能抑制LPS诱导的小胶质细胞效应，自噬诱导剂诱导经典型自噬激活可抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症激活和细胞死亡。

炎症小体是由细胞内多蛋白组成的复合物。目前已发现的炎症小体主要有4种：NLRP1、NLRP2、NLRP3和AIM2。几乎所有的炎性体之中都含有炎性蛋白(NOD-like receptor，NLR)，统称NOD样受体家族。在小胶质细胞/巨噬细胞中的炎症小体主要是NLRP3，当细胞受到各种病理刺激时，NLRP3炎症小体激活，通过产生活性的CASP1，进一步促进重要炎症细胞因子IL-1β的成熟和释放[27]。2011年，Tschopp研究组[28]在Nature期刊报道，THP1细胞和巨噬细胞中损伤线粒体释放的ROS是调控NLRP3炎症小体激活的关键信号。激活自噬减少损伤线粒体数量，可预防ROS促进的NLRP3炎症小体激活，反之，自噬不足则加剧NLRP3炎症小体激活。另一文献表明相似的观点，自噬抑制或不足导致TLR配体介导的IL-1α, IL-1β和IL-18分泌增加，这是TRIF和线粒体ROS/DNA依赖的，而激活自噬减少LPS诱导的pro-IL-1β和IL-1β水平，提示自噬作为IL-1家族的关键调节者，负性调节炎症反应[29]。进一步对巨噬细胞自噬调节炎症反应的作用机制研究表明，自噬对炎症小体/IL-1β通路存在三个重要的作用环节：首先，自噬通过消化机能障碍的线粒体，预防线粒体释放ROS对NLRP3炎症小体的激活作用，提示自噬可能通过维持线粒体稳态调节炎性反应。其次，自噬通过降解炎症小体复合物，防止pro-IL-1β裂解成活性的细胞因子产物。最后，自噬通过包裹并降解pro-IL-1β蛋白，调控IL-1β的成熟和释放[30-31]。与巨噬细胞相似，最近实验结果表明自噬调节小胶质细胞NLRP3炎症小体激活[1,17]。另一方面，NLRP3炎症小体和IL-1家族能诱导自噬激活，提示存在炎症和自噬的相互作用[27,29,32]。

4 结语

大量的实验数据证明，神经炎症反应在脑缺血和中枢神经退行性疾病的发生发展中起重要作用，自噬通过影响小胶质细胞炎症激活参与脑损伤后炎症病理过程。本文综述了近年来神经炎症和自噬在脑损伤病理过程中的作用研究进展，为寻找神经炎症的重要治疗靶点提供依据。随着神经科学实验技术和方法的不断发展和更新，小胶质细胞自噬和神经炎症与脑损伤的关系研究也正在不断进展。因此，深入了解神经炎症和自噬在中枢神经系统疾病发病过程中的调控作用及机制，将有助于阐明炎症相关的中枢疾病的病理生理特点，并进一步为相关中枢疾病的防治和药物研发提供新策略。

[1] Plaza-Zabala A, Sierra-Torre V, Sierra A. Autophagy and Microglia: Novel Partners in Neurodegeneration and Aging [J]. Int J Mol Sci, 2017,18(03): E598.

[2] Glass CK, Saijo K, Winner B,etal. Mechanism underlying inflammation in neurodegeneration [J]. Cell, 2010,140 (06):918-934.

[3] Shi QJ, Wang H, Liu ZX,etal. HAMI 3379, a CysLT2R antagonist, dose- and time-dependently attenuates brain injury and inhibits microglial inflammation after focal cerebral ischemia in rats [J]. Neuroscience, 2015,291:53-69.

[4] Zhang XY, Wang XR, Xu DM,etal. HAMI 3379, a CysLT2 receptor antagonist, attenuates ischemia-like neuronal injury by inhibiting microglial activation [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2013,346(02):328-341.

[5] Alam Q, Alam MZ, Mushtaq G,etal. Inflammatory Process in Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Central Role of Cytokines [J]. Curr Pharm Des, 2016,22(05):541-548.

[6] Kavanagh E, Burguillos MA, Carrillo-Jimenez A,etal. Deletion of caspase-8 in mouse myeloid cells blocks microglia pro-inflammatory activation and confers protection in MPTP neurodegeneration model [J]. Aging (Albany NY), 2015,7(09):673-689.

[7] Bournival J, Plouffe M, Renaud J,etal. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system [J]. Oxid Med Cell Longev, 2012, 12:921941.

[8] Fu AK, Hung KW, Yuen MY,etal. IL-33 ameliorates Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016,113(19):E2705-2713.

[9] Cui YQ, Jia YJ, Zhang T,etal. Fucoidan protects against lipopolysaccharide-induced rat neuronal damage and inhibits the production of proinflammatory mediators in primary microglia [J]. CNS Neurosci Ther, 2012,18(10):827-833.

[10] Chen L, Yang Y, Li CT,etal. CysLT2 receptor mediates lipopolysaccharide-induced microglial inflammation and consequent neurotoxicity in vitro [J]. Brain Res, 2015,1624:433-445.

[11] Frake RA, Ricketts T, Menzies FM,etal. Autophagy and neurodegeneration [J]. J Clin Invest, 2015,125(01):65-74.

[12] Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A,etal. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition) [J]. Autophagy, 2016;12(01):1-222.

[13] Yang Z, Zhong L, Zhong S,etal. Hypoxia induces microglia autophagy and neural inflammation injury in focal cerebral ischemia model [J]. Exp Mol Pathol, 2015,98:219-224.

[14] Zhou X, Zhou J, Li X,etal. GSK-3β inhibitors suppressed neuroinflammation in rat cortex by activating autophagy in ischemic brain injury [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 411:271-275.

[15] Hung KC, Huang HJ, Wang YT,etal. Baicalein attenuates α-synuclein aggregation, inflammasome activation and autophagy in the MPP+-treated nigrostriatal dopaminergic system in vivo [J]. J Ethnopharmacol, 2016,194:522-529.

[16] Lu M, Su C, Qiao C,etal. Metformin prevents dopaminergic neuron death in MPTP/P-induced mouse model of Parkinson’s disease via autophagy and mitochondrial ROS clearance[J] . Int J Neuropsychopharmacol, 2016,19(09):1-11.

[17] Cho MH, Cho K, Kang HJ,etal. Autophagy in microglia degrades extracellular-amyloid fibrils and regulates the NLRP3 inflammasome [J] . Autophagy, 2014,10:1761-1775.

[18] François A, Terro F, Quellard N,etal. Impairment of autophagy in the central nervous system during lipopolysaccharide-induced inflammatory stress in mice [J]. Mol Brain, 2014,7:56.

[19] Zheng HF, Yang YP, Hu LF,etal. Autophagic impairment contributes to systemic inflammation-induced dopaminergic neuron loss in the midbrain [J]. PLoS One, 2013,8(08):e70472.

[20] Han HE, Kim TK, Son HJ,etal. Activation of Autophagy Pathway Suppresses the Expression of iNOS, IL6 and Cell Death of LPS-Stimulated Microglia Cells [J]. Biomol Ther (Seoul), 2013,21(01):21-28.

[21] Fujita K, Srinivasula SM. TLR4-mediated autophagy in macrophages is a p62-dependent type of selective autophagy of aggresome-like induced structures (ALIS) [J]. Autophagy, 2011,7(05):552-554.

[22] Canadien V, Tan T, Zilber R,etal. Cutting edge: microbial products elicit formation of dendritic cell aggresome-like induced structures in macrophages [J]. J Immunol, 2005,174(05):2471-2475.

[23] Xu Y, Jagannath C, Liu XD,etal. Toll-like receptor 4 is a sensor for autophagy associated with innate immunity.Immunity [J]. 2007,27(01):135-1344.

[24] Wang D, Zhang J, Jiang W,etal. The role of NLRP3-CASP1 in inflammasome-mediated neuroinflammation and autophagy dysfunction in manganese-induced, hippocampal-dependent impairment of learning and memory ability [J]. Autophagy, 2017,13(05):914-927.

[25] Shao BZ, Ke P, Xu ZQ,etal. Autophagy plays an important role in anti-inflammatory mechanisms stimulated by alpha7 nicotinic acetylcholine receptor [J]. Front Immunol, 2017,8:553.

[26] Bussi C, Ramos JM, Arroyo DS,etal. Autophagy down regulates pro-inflammatory mediators in BV2 microglial cells and rescues both LPS and alpha-synuclein induced neuronal cell death [J]. Sci Rep, 2017,7:43153.

[27] Chen S, Sun B. Negative regulation of NLRP3 inflammasome signaling. Protein Cell, 2013,4(04):251-258.

[28] Zhou R, Yazdi AS, Menu P,etal. A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation [J]. Nature, 2011, 7329:221-225.

[29] Harris J. Autophagy and IL-1 Family Cytokines [J]. Front Immunol, 2013,4:83.

[30] Netea-Maier RT, Plantinga TS, van de Veerdonk FL,etal. Modulation of inflammation by autophagy: Consequences for human disease [J]. Autophagy, 2016,12(02):245-260.

[31] Kim MJ, Yoon JH, Ryu JH. Mitophagy: a balance regulator of NLRP3 inflammasome activation [J]. BMB Rep, 2016,49(10):529-535.

[32] Shi CS, Shenderov K, Huang NN,etal. Activation of autophagy by inflammatory signals limits IL-1β production by targeting ubiquitinated inflammasomes for destruction [J]. Nat Immunol, 2012,13(03):255-63.