细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3在肿瘤中的研究进展

刘 娟 综述 张澍田 审校

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(Cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)是一种细胞周期调控蛋白，可直接或间接与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent protein kinase，CDK)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子等相互作用，参与细胞周期调控。由于调控细胞周期的基因表达异常与肿瘤的发生发展密切相关，对肿瘤的靶向治疗意义重大[1-2]，因此，CDKN3在肿瘤中的功能及机制研究越来越广泛。然而，随着对CDKN3研究的不断深入，发现其在不同类型肿瘤组织中发挥不同作用，不仅参与细胞周期调控，对细胞凋亡及侵袭迁移能力也有影响。由此，本文通过对CDKN3在肿瘤中的作用机制研究结果进行回顾，从CDKN3在细胞周期调控、细胞凋亡及侵袭迁移中的作用、CDKN3突变体及其亚细胞定位四个方面对CDKN3在肿瘤中抑癌/促癌机制的研究进展进行概述，为下一步基础及临床研究提供思路，从而促进CDKN3的临床转化应用，以提高肿瘤的临床诊治水平。

1 CDKN3基因概述

CDKN3基因最早于1994年由Hannon等应用酵母双杂交体系研究与CDK2相互作用蛋白时从HeLa细胞发现，因其可与CDK结合，曾被命名为KAP(CDK-associated phosphatase)，该研究发现KAP为双特异性磷酸酶，在酵母中可与CDK2和CDC2相互作用，且在哺乳动物中更倾向于与CDC2结合[3]。1995年通过FISH技术定位其染色体位置为14q22，包含212个氨基酸，分子量23 kD，是一种双特异性磷酸酶蛋白，属于CDC14s家族，可对磷酸化丝氨酸/苏氨酸发挥去磷酸化作用[4-5]。

然而，随着对CDKN3的深入研究发现，CDKN3在不同肿瘤类型中发挥不同的功能。在胶质母细胞瘤、慢性粒细胞性白血病及神经母细胞瘤中可抑制细胞增殖[6-9]，作为抑癌基因发挥功能，但在肝癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌及乳腺癌中则呈高表达，促进细胞增殖进而发挥促癌作用，并且在肺癌、宫颈癌、甲状腺癌及肾癌中CDKN3高表达提示预后不良[8，10-18]。在肿瘤诊断方面，CDKN3高表达识别宫颈癌组织的敏感性达93%，特异性达96%，并可以识别宫颈高级别上皮内瘤变及低级别上皮内瘤变[19]，由此推测其在早癌及癌前疾病诊断方面亦有重要价值。此外，CDKN3还与肿瘤耐药性相关[20]。因此，CDKN3在肿瘤诊治及预后判断中均有重要作用，但目前对于CDKN3在肿瘤发生发展中发挥不同作用的机制尚不确定。

2 CDKN3在肿瘤中的作用机制研究进展

2.1 CDKN3在细胞周期调控中的作用

CDK2在调控G1/S期中发挥重要作用，CDK2 Thr160磷酸化可促进细胞周期从G1期进入S期[21]，促进细胞增殖。CDKN3可将CDK2活化必需的Thr160去磷酸化[3]，抑制其对视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma，Rb)的磷酸化作用，未磷酸化的Rb蛋白可以与转录因子E2F1结合，抑制G1/S期转化，从而抑制细胞增殖。Chen等[8]在白血病K562细胞系中过表达CDKN3后，磷酸化CDK2表达下调，抑制细胞G1/S期转化，敲低CDKN3表达后获得相反结果，同时CDKN3过表达可抑制正常骨髓细胞向白血病细胞转化，证实CDKN3通过去磷酸化CDK2抑制G1/S期转化进而发挥抑癌作用。CDKN3不仅参与调控G1/S期转化，Nalepa等[22]研究结果表明CDKN3在细胞分裂期也有一定调控作用，该研究发现当HeLa细胞进入分裂期时，内源性CDKN3的分布由分裂间期的细胞核转为中心体，在分裂后期通过对CDK1 Thr161去磷酸化作用，维持中心体正常数目，调控细胞周期，当敲低CDKN3表达后，出现中心体数量异常的同时，细胞周期进程也会加快。此外，也有研究表明CDKN3在分裂期可与磷酸化的Mps1结合，诱导其降解，以维持Mps1在中心体的正常水平，避免因中心体过度复制引起细胞异常分裂[23]。因此，CDKN3通过调控G1/S期和细胞分裂后期中心体数量，维持细胞正常分裂，发挥抑癌作用。

CDKN3作为促癌基因对细胞周期的调控作用通过促进G1/S期转化实现，但在不同肿瘤细胞中相关的作用蛋白不尽相同。在结直肠癌SW480细胞中，敲低CDKN3导致G1/S期停滞与CDKN1和PCNA的表达水平下调相关[24]，在胃癌SGC-7901细胞中则与CDK2、CDC25A、CCNB1和CCNB表达下调相关[14]，在前列腺癌及卵巢癌细胞中均与PCNA和CDK2表达下调相关[12，18]。此外，CDKN3亦可与MDM2-p53形成复合物，通过抑制p21表达促进细胞周期进程[25]。就目前研究结果而言，PCNA和CDK2在多种肿瘤中的表达水平均受CDKN3影响，是否提示这两种蛋白是CDKN3促进细胞周期进程的核心蛋白以及可能的作用通路仍需更深入的研究。

2.2 CDKN3突变体

2000年，Yeh等[26]首次在进展期肝癌活检组织、手术切除早期肝癌/癌旁组织、肝炎组织中发现CDKN3突变体。该研究发现在12例肝炎组织中均为野生型CDKN3，13例早期肝癌组织中6例出现突变体，除1例外均与野生型CDKN3共存，而在14例进展期肝癌组织中8例出现突变体，仅2例与野生型共存，表明在肝癌进展过程中，野生型CDKN3表达逐渐减少，进一步对突变体研究发现，仅T4-2和T7两种突变体可与CDK2结合，但无去磷酸化作用，因此可竞争性抑制野生型CDKN3的抑癌功能，进而促进肿瘤细胞增殖。2003年，该团队又从肝母细胞瘤细胞系HepG2中检测到K2-K6五种CDKN3剪接异构体，通过酵母双杂交体系发现CDKN3与CDK2相互作用的位点在氨基端1-34氨基酸区域，拥有该结构域的剪接异构体可干扰野生型CDKN3与CDK2的相互作用[27]。为明确CDKN3突变体在其他肿瘤中的表达情况，Yu等[6]在胶质母细胞瘤中发现2种剪接异构体(外显子2和3异常剪接)，均不能翻译全长的CDKN3，导致CDKN3 mRNA水平升高，但野生型CDKN3蛋白水平降低。因此，在肿瘤进展过程中，由于CDKN3突变体出现，一方面可降低野生型CDKN3蛋白表达水平，另一方面可与CDK2结合竞争性抑制野生型CDKN3的抑癌功能，这解释了在某些肿瘤中虽然CDKN3高表达，但仍是一种抑癌基因。

然而，Pita等[17]的研究结果表明，CDKN3在正常甲状腺组织中均为野生型，在低/未分化甲状腺癌中存在以外显子2缺失为主的异常剪接体，但仍以野生型CDKN3为主，且与正常甲状腺组织相比，肿瘤组织中野生型及总CDKN3(野生型+异常剪接体)mRNA水平均显著升高，提示CDKN3突变体在甲状腺癌中并不影响野生型CDKN3的表达。此外，在宫颈癌中的研究也获得相似结果[13]，该研究在45例宫颈癌组织、22例正常组织及CaSki，HeLa和SiHa三种宫颈癌细胞系中检测到多种CDKN3转录突变体，但均以野生型为主，且每种突变体的mRNA水平在肿瘤与正常组织中无显著差异，而Western blot仅能检测到野生型CDKN3，同时在3系宫颈癌细胞中转染仅对野生型CDKN3具有敲低作用的siRNA后，细胞增殖能力降低。由此，CDKN3在甲状腺癌及宫颈癌中呈高表达发挥促癌作用，并非因突变体的存在降低野生型CDKN3蛋白表达或抑制野生型CDKN3功能所致。

2.3 CDKN3在细胞凋亡及侵袭迁移中的作用

尽管CDKN3是一种周期相关蛋白，但Yu等[6]在胶质母细胞瘤研究中发现，CDKN3亦可通过间接作用于CDK1，抑制细胞迁移能力。进一步深入研究其作用机制发现，CDKN3一方面可通过直接结合并活化ROCK2，抑制RAC1、PAK1，进而抑制细胞侵袭迁移能力，另一方面CDKN3可去磷酸化CDK2，进而降低磷酸化Rb，增加未磷酸化Rb与E2F结合，间接抑制CDK1作用，抑制侵袭迁移[7]。目前，对CDKN3促进细胞凋亡的相关研究发现，其可通过降低磷酸化CDK2蛋白水平，抑制下游抗凋亡蛋白XIAP的表达，进而促进细胞凋亡[8]，发挥抑癌作用。

CDKN3抑制细胞凋亡机制因肿瘤类型不同而不同。在乳腺癌细胞系中，通过影响Bcl-2与Bax表达抑制细胞凋亡[16]，在肝癌Huh-7细胞中，则通过影响凋亡相关活性蛋白PTEN、GSK、p44/42和AKT表达，抑制细胞凋亡[28]。此外，CDKN3促进肿瘤侵袭迁移的作用与侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9表达水平相关[18]。

2.4 CDKN3亚细胞定位

Lai等[15]在58例肾癌组织中通过免疫组化检测CDKN3表达及分布情况，结果表明CDKN3主要位于肾癌细胞的细胞核，胞浆分布多出现在低分化癌细胞中。而Barron等[13]研究结果表明，在宫颈癌组织中，CDKN3在细胞浆和细胞核均有表达且要强于正常宫颈组织，在HPV16阳性癌组织中，以胞浆分布为主，在其他HPV阳性组织中则无此现象。目前关于CDKN3亚定位相关研究较少，因此，CDKN3在不同肿瘤组织中发挥不同作用是否因亚细胞定位不同所致，是CDKN3亚细胞定位改变引起肿瘤发生发展还是其他因素，如细胞分化程度、HPV感染等引起其亚细胞定位发生改变等问题仍需进一步研究。

3 小结与展望

由于肿瘤的发生发展机制不明确，导致肿瘤的早期治疗及预后差强人意。CDKN3在肿瘤诊断、治疗耐药及预后判断方面均发挥作用，临床应用前景广阔。目前相关研究结果表明CDKN3作用机制涉及到细胞周期、凋亡、侵袭迁移及突变体等多个方面，但仍不能解释为何其在不同类型肿瘤的发生发展过程中发挥不同的作用。因此，下一步基础研究应明确在细胞癌变过程中与CKDN3相互作用的关键底物及作用通路，并在临床多组织类型、不同病理级别的样本中评价CDKN3在肿瘤早诊及治疗方面的价值，以尽快实现CDKN3临床转化应用，提高肿瘤诊治水平并改善预后。