锰超氧化物歧化酶在肿瘤发生发展过程中的研究进展

顾琦晟 综述 李继坤 审校

在肿瘤的发生发展过程中，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的作用受到了极大关注。由于基因突变、代谢异常变化和肿瘤微环境的改变等，肿瘤细胞的ROS水平普遍明显升高，从而影响氧化应激信号通路，并进一步造成DNA和蛋白质的损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutases，SODs)是生物体中最普遍的一类抗氧化酶，用于专一清除超氧阴离子自由基(O2-)，其中锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，MnSOD)被认为是哺乳动物最重要的SOD[1]。早期研究认为MnSOD的下调诱导肿瘤发生发展，但后续相关研究发现MnSOD的表达水平在多种恶性肿瘤中反而升高。MnSOD在不同恶性肿瘤的发生发展阶段中发挥不同作用。揭示其调节机制，能够加深对肿瘤发生发展与氧化应激的认识，为逆转肿瘤耐药、提高放化疗效果提供新线索。

1 MnSOD的基因结构特点和生物学特性

人MnSOD基因是核编码基因，位于染色体6q25.3，包含5个外显子和4个内含子。其5′端启动子区由富GC序列取代了常见的TATA盒或CAAT盒，主要的转录因子Sp1(Specificity protein 1)和AP-2(Activating protein 2)的结合位点即位于此。Sp1结合于启动子激活MnSOD的转录，而AP-2通过与Sp1竞争结合位点或与Sp1形成复合体以抑制MnSOD的转录。此外，上游启动子区也有AP-1、HIF-1α、p53、C/EBP、Nrf2、FoxO3a等转录因子结合位点，共同对MnSOD的表达进行调控[2]。

SODs共有三种亚型：Cu/Zn-SOD位于细胞质和线粒体膜间隙；MnSOD位于线粒体基质中；EC-SOD位于细胞外。O2-主要来源于线粒体电子传递链的泄露，而O2-难以穿膜，蓄积易造成线粒体DNA的损伤。MnSOD通过快速将线粒体基质中的O2-催化为过氧化氢(H2O2)，随后H2O2跨膜弥散降低浓度并被过氧化氢酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)进一步催化为水分子，从而保护线粒体DNA免于ROS的氧化损伤。有报道称MnSOD的敲除对新生小鼠有致死作用，而Cu/Zn-SOD的过表达不能逆转MnSOD敲除小鼠的死亡，提示MnSOD对生物体有着不可或缺的重要作用[3]。

2 MnSOD在不同肿瘤细胞内的表达水平和功能

由于MnSOD清除线粒体基质内O2-、保护线粒体DNA的功能明确，早期研究认为MnSOD是一类肿瘤抑制分子。MnSOD在乳腺癌、胰腺癌等肿瘤组织中的活性和表达水平比正常组织更低，而在离体实验和动物实验中发现过表达MnSOD可有效减缓肿瘤细胞的生长[4-5]。此外，适量水平的ROS与细胞周期相关，MnSOD的下调表达会诱使线粒体释放更多O2-以维持细胞周期进程，进而造成线粒体DNA、蛋白质、膜脂质等生物大分子的损害或诱导细胞凋亡[6]。

但也有研究发现，MnSOD在结直肠癌、鼻咽癌等肿瘤组织中表达水平升高，并提示MnSOD与肿瘤的高侵袭性和耐药性密切相关[7-8]。研究表明，抗氧化酶的高表达是肿瘤在发展过程中生存适应的结果[9]。高MnSOD表达能够在高代谢的肿瘤微环境下和转移过程中与胞外基质解离的状态下保护肿瘤细胞线粒体，通过催化生成高浓度的H2O2刺激氧化还原信号通路，进一步促进血管生成和细胞迁移等加速肿瘤的生长侵袭[10]。因此，MnSOD的表达水平差异与肿瘤的细胞类型相关。MnSOD的低表达往往诱导肿瘤发生，而高表达通常伴随着肿瘤生存和侵袭能力的增加。

3 MnSOD在肿瘤中表达和酶活性的调控机制

与常见的癌基因和抑癌基因不同，MnSOD基因在肿瘤中很少有突变或扩增，其表达水平的变化原因主要是适应性变化，与转录调控、转录后调控和翻译后调控相关。

3.1 转录调控

MnSOD的主要转录因子Sp1和AP-2分别是最重要的激活和抑制因子。两者相互竞争性抑制，维持MnSOD的稳定转录。肿瘤细胞中Sp1和AP-2的相对丰度与MnSOD的表达水平密切相关，其它转录因子能够通过与Sp1或AP-2相互作用，改变Sp1和AP-2的相对丰度，从而影响MnSOD的转录水平。一项侵袭性乳腺癌的研究发现，DDB2蛋白导致Sp1低表达，并作为MnSOD的负调节因子影响肿瘤的生长[11]。另外，其它转录因子也能够通过各自独有的信号通路影响MnSOD的转录水平。

3.1.1 原癌基因和抑癌基因相关调控 原癌基因和抑癌基因的表达能够影响MnSOD转录。c-myc是一类经典的原癌基因，舌鳞癌研究中发现c-myc蛋白可与MnSOD基因的启动子直接结合，上调MnSOD的转录并提高肿瘤细胞的侵袭迁移能力[12]。在乳腺癌的发生阶段，原癌基因Ras的激活能够明显下调MnSOD的转录，升高胞内氧自由基水平进而诱导细胞代谢重编程，转为糖酵解模式[13]。

MnSOD基因的5′端启动子区已确认有p53的结合位点。促癌剂TPA能够驱动p53转位至线粒体内，直接与MnSOD结合并抑制其活性，促使线粒体氧自由基超载并启动细胞凋亡[14]。另外p53还能够通过与其他转录因子的间接作用调节MnSOD转录。Dhar等利用皮肤癌模型，发现DMBA和TPA诱导p53激活后，通过抑制Sp1与MnSOD结合下调MnSOD转录；而病变进展为鳞癌时，p53水平下调，通过NF-κB通路促进MnSOD转录水平恢复甚至升高，提示高水平p53抑制MnSOD转录，而低水平p53促进MnSOD的转录[15]。

3.1.2 氧化应激相关调控 在肿瘤进展的过程中，MnSOD的表达上调主要与氧化应激相关通路有关。肿瘤微环境中的生长因子、细胞因子等胞外信号刺激和胞内高水平ROS激活的胞内信号刺激是最主要的初始信号来源，同时这些信号的抑制也可下调肿瘤细胞中MnSOD的表达。其中研究最深入的是NF-κB通路、Keap1/Nrf2/ARE通路和FoxO3a相关通路。

NF-κB是一个经典的应激相关转录因子，能够在各种细胞因子、辐射、微环境改变等刺激下被激活。NF-κB已被证实可通过与MnSOD内含子中的增强子区域直接结合，募集Sp1结合MnSOD启动子，并与组蛋白的高乙酰化密切相关[16]。Kamarajugadda等发现NF-κB能够通过刺激MnSOD高表达并减少葡萄糖氧化代谢，避免过度ROS的产生，从而抵抗肿瘤细胞的失巢凋亡，促进肿瘤远处转移[17]。

Nrf2是细胞抗氧化反应防御机制中一个重要的转录因子，与细胞骨架相关蛋白Keap1解离后转位入细胞核，和抗氧化反应元件(Antioxidant response element，ARE)相互作用，调节抗氧化酶的表达。Hart等在乳腺癌研究中发现，Nrf2的上调表达能够驱动MnSOD的过表达，使线粒体内H2O2水平显著升高并激活AMPK途径，导致肿瘤细胞代谢重编程[18]；Carlisi等发现Nrf2的下调表达能够抑制MnSOD表达，提升胞内ROS水平，减弱肿瘤细胞的耐药性[19]。

FoxO3a是叉头框蛋白家族的一员，具有特征性的Fox结构域，可与MnSOD上游启动子结合，调控MnSOD表达。PI3K/Akt通路能够通过磷酸化FoxO3a，诱导其核排斥，从而下调MnSOD转录，上调胞内ROS水平[20]。此外，FoxO3a也可与去乙酰化相关酶Sirtuin相互作用，去乙酰化后的FoxO3a加强与MnSOD的结合并上调转录，促进肿瘤细胞生存[21]。

3.1.3 表观遗传相关调控 几乎所有人类肿瘤均存在表观遗传上的异常，其改变主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰，可改变DNA结构功能、影响基因转录。一项非小细胞肺癌的研究发现，MnSOD的CpG岛被甲基化导致基因沉默，产生假性缺氧的微环境并刺激缺氧诱导因子(HIF-1α)过表达，改变肿瘤细胞代谢状态[22]。Hitchler等发现，MnSOD调节元件的组蛋白乙酰化和甲基化修饰抑制Sp1和NF-κB与MnSOD启动子的结合，从而下调表达[23]。肿瘤发生早期MnSOD表观遗传调控紊乱导致转录下调，而在肿瘤发展过程中，TET蛋白家族和SIRT、HDAC蛋白家族能够通过去甲基化、去乙酰化逆转表观遗传紊乱，恢复MnSOD水平以加强肿瘤微环境下细胞的生存能力[24]。

3.2 转录后调控

MnSOD的mRNA受到各类转录后调控的作用，近年来肿瘤细胞中miRNA调节MnSOD mRNA表达的研究较为丰富。MiR-21经p53刺激上调后可下调MnSOD mRNA表达并降低肝癌细胞的耐药性[25]；MiR-509-5p在乳腺癌中的下调使MnSOD表达下调并加强肿瘤细胞的增殖、迁移能力[26]。相关报道较多，但大多主要指出miRNA与MnSOD表达水平的相关性，其内在机制除了对MnSOD mRNA转录后调节之外，更多地在于和上述癌基因、抑癌基因和氧化应激相关通路的中枢分子等的mRNA相互作用，在MnSOD上游进行调控，而明确证实miRNA与MnSOD mRNA直接结合进行转录后调节的仍然较少。房静远等发现LncRNA Gclnc1通过调控MnSOD导致胃癌发生，提示LncRNA对于MnSOD的转录后调控具有重要作用，具有广阔的研究空间[27]。

3.3 翻译后调控

在MnSOD与肿瘤的相关研究中，主要通过衡量MnSOD的表达水平确定其功能高低，然而MnSOD可通过翻译后修饰进一步在蛋白质水平进行酶活性调节。此外，MnSOD蛋白的多态性也会对其酶活性造成影响。因此在特定的环境下，MnSOD的高表达并不一定意味着MnSOD的酶活性升高，MnSOD蛋白活性的调节同样不容忽视[28]。

3.3.1 翻译后修饰 与绝大多数蛋白类似，MnSOD蛋白能够在特定环境下被各种基团修饰，通过磷酸化、乙酰化、泛素化等方式调节酶活性。Jin等对细胞给予低剂量电离辐射后发现，细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4可直接磷酸化MnSOD的Ser106，并增强酶活性以应对环境的生存压力[29]。Torrensmas等在结肠癌研究中发现，沉默SIRT3使MnSOD乙酰化，能够降低酶活性并增加ROS产生，促进细胞凋亡[30]。此外，还有泛素化、氧化、硝化等修饰方式，但尚未在肿瘤中有深入研究。通过基团修饰快速调节MnSOD酶活性，可能与调节胞内ROS水平、进而调节MnSOD相关氧化还原信号通路、转换MnSOD在肿瘤发生发展中的功能有密切关系，亟待更进一步的研究探讨。

3.3.2 蛋白质多态性 非同义的单核苷酸多态性会导致蛋白质序列的改变，进而影响蛋白质功能。由于SNP和人种密切相关，许多研究将MnSOD的多态性和不同人种人群对化疗、放疗的耐药性相联系，其中最广泛的、最受人关注的是Val16Ala异构体。早期研究发现Val16Ala异构的MnSOD更难转位进入线粒体，且容易造成蛋白质错误折叠[31]。有多项荟萃分析对此进行了报道，结果表明Ala等位基因增加了前列腺癌等肿瘤的患病风险[32]，但也有乳腺癌相关荟萃分析称Ala等位基因与患病率和生存率无关[33]。MnSOD多态性在不同肿瘤类型间作用不同的原因仍有待探索。

4 小结与展望

现在主要的抗肿瘤方法中除手术外，仍以放、化疗为主。两者的主要杀伤方式均是诱导肿瘤细胞产生大量的ROS，引起细胞凋亡或坏死。肿瘤细胞能够通过调控MnSOD表达，适应新的高ROS微环境，使放化疗的杀伤力下降，因此MnSOD被认为是肿瘤细胞抵抗放化疗的一个核心因素，也是一个极具潜力的肿瘤治疗靶点。通过不同水平的刺激或抑制等手段影响MnSOD表达水平，打破肿瘤细胞线粒体内ROS稳态，使O2-和H2O2等不同ROS组分的水平超出细胞清除能力范围，进而通过caspase途径或线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。相信随着CRISPR/Cas9、单细胞测序等新技术的发展，可以进一步阐明MnSOD在肿瘤细胞中功能转换的机制，大幅促进肿瘤的线粒体靶向治疗、抗耐药、抗耐辐射等方面的临床转化研究，为广大肿瘤患者带来福音。