川芎提取物通过激活Nrf2通路对抗心肌缺血大鼠氧化应激损伤

汪刚+刘莹+侯雪峰+柯仲成+封亮+贾晓斌

[摘要] 川芎是临床常用于心脑血管疾病的一味中药，现代医学证实川芎提取物具有良好的抗氧化活性。该文主要探讨川芎提取物对大鼠心肌缺血损伤氧化应激干预作用及可能的机制。采用皮下注射盐酸异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血损伤模型，记录各组大鼠心脏指数，比色法检测血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）的活性及血清中丙二醛（MDA）含量，同时光镜下观察心肌组织形态学变化，Western blot法检测心肌组织中核因子E2相关因子2（Nrf2）、醌氧化还原酶（NQO1）和血红素氧合酶-1（HO-1）蛋白表达的变化。结果显示，川芎提取物能显著降低心脏指数和血清心肌酶CK，LDH，AST水平，提高血清SOD和T-AOC活性并降低MDA含量，改善缺血损伤后心肌组织形态结构，增加心肌组织中Nrf2，NQO1，HO-1 蛋白的相对表达。该研究表明川芎提取物对大鼠心肌缺血损伤具有保护作用，其机制可能与激活Nrf2信号通路，增加心肌组织抗氧化能力，抑制氧化应激反应有关。

[关键词] 川芎； 氧化应激； 心肌缺血损伤； Nrf2信号通路

[Abstract] Ligusticum chuanxiong is one of the common traditional Chinese medicinal herbs for treating various cardiovascular and cerebrovascular diseases， and a number of previous studies have demonstrated that the extract of L. chuanxiong has strong antioxidative activity. This paper was mainly aimed to investigate the effects and possible mechanisms of L. chuanxiong extraction on oxidative stress induced by myocardial ischemia injury in rats. The rats were subcutaneously injected with isoprenaline hydrochloride to induce myocardial ischemia injury and treated for 2 weeks. Then the cardiac indexes of the rats were recorded. The concentration of malondialdehyde （MDA） and activities of serum creatine kinase （CK）， lactate dehydrogenase （LDH）， aspartate transaminase （AST）， superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） were measured by colorimetry. Light microscope was used to observe the morphological changes of myocardium， and the protein expressions of nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2）， quinone oxidoreductase （NQO1） and hemeoxygenase-1 （HO-1） in cardiac tissue were evaluated by Western blot. The results showed that L. chuanxiong extraction could decrease cardiac indexes and the values of CK， LDH and AST in blood serum， increase activities of serum SOD and T-AOC， reduce serum MDA concentration， improve myocardium structure after ischemia injury， and up-regulate the protein expressions of Nrf2， NQO1 and HO-1 in cardiac tissue. These findings revealed that the cardioprotective effects of L. chuanxiong extraction may be related to inhibiting oxidative stress through the activation of Nrf2 signaling pathway.

[Key words] Ligusticum chuanxiong； oxidative stress； myocardial ischemia injury； Nrf2 signaling pathway

心肌缺血損伤是指由于心脏供血量减少和供养不足，从而导致心肌能量代谢异常，心肌结构和功能发生改变[1]。其发生机制可能与多种因素有关，具有多层次、多靶点的特点。大量临床和实验研究表明氧化应激在心肌缺血性损伤性疾病的发生发展过程中扮演着重要的作用[2-3]，心肌缺血时伴随有大量活性氧簇（ROS）产生和堆积，引发机体内源性氧化应激，心肌细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应。一方面促进心肌细胞凋亡和心肌组织坏死；另一方面造成细胞膜通透性和流动性发生改变，导致胞内大量心肌酶外漏，加重心肌缺血损伤[4-5]。因此，有效地干预内源性氧化应激是改善心肌缺血损伤和保护心肌组织的重要途径。endprint

川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根茎，素有“行气活血，祛风止痛”之功效。现代研究表明川芎具有较好的抗心肌缺血药效，广泛应用于冠心病、心绞痛、动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗与预防[6-7]。近年来研究证实川芎及其有效成分具有显著的抗氧化活性，对机体产生的羟基自由基、过氧化氢超氧自由基、氢自由基、过氧化亚硝基等活性氧簇都有一定的清除作用[8-10]，但其抗心肌缺血氧化应激损伤的作用机制目前尚不明确。故本研究建立大鼠心肌缺血模型，观察不同川芎提取物预处理对心肌缺血损伤的影响，旨在探讨川芎提取物通过其抗氧化应激作用发挥心肌缺血损伤保护作用机制。

1 材料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠，SPF级，体质量（200±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK（沪）2016-0125。所有大鼠均分笼，并饲养于江苏省中医药研究院实验动物中心，适应性喂养1周后开始实验。饲养条件：温度（25±1） ℃，相对湿度（45±5）%，光暗各12 h，自由进食饮水。

1.2 药物与试剂 川芎（亳州市万珍中药饮片厂，批号1604109）；盐酸地尔硫卓片（天津田边制药有限公司，批号1603019）；盐酸异丙肾上腺素（Sigma，批号WXBC2200V）；水合氯醛（中國医药集团上海化学试剂公司，批号F20160116）；肌酸激酶（CK）试剂盒（批号20161012），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号20161012），天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒（批号20161012），丙二醛（MDA）试剂盒（批号20161023），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号20161023），总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（批号20161023）均购自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Nrf2单克隆抗体，兔抗大鼠NQO1单克隆抗体，兔抗大鼠HO-1单克隆抗体购自英国Abcam公司；BCA蛋白含量检测试剂盒，ECL化学发光试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.3 仪器 ECGV-6012心电图机（深圳卫康明科技有限公司）；MS105DU型分析天平（美国Mettler Toledo公司）；全自动酶标仪（ThermoElectrom公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；CHA-S型数显气浴恒温振荡器（金坛市双捷实验仪器厂）；TL-820A型全自动切片机（湖北泰维科技实业有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；PNHW型电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；Hei-VAP Value Digital型旋转蒸发仪（德国Heidolph仪器有限公司）；Western电泳仪（美国 Bio-Rad公司）；JS-1070化学发光凝胶成像分析系统（上海培清科技有限公司）。

2 方法

2.1 提取物制备 川芎醇提物制备：称取500 g川芎，加入10倍体积的80%乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，减压浓缩至干浸膏，加蒸馏水溶解至所需溶液浓度。

川芎水提物制备：称取500 g川芎，加入10倍体积水煎煮2次，每次1.5 h，合并2次提取液，减压浓缩至干浸膏，加蒸馏水溶解至所需溶液浓度。

2.2 分组与给药 取健康SD大鼠56只，随机分成7组，分别为空白组（给予等量蒸馏水）、模型组（给予等量蒸馏水）、阳性对照药盐酸地尔硫卓组（20 mg·kg-1）、川芎醇提物高剂量组（1 200 mg·kg-1）、川芎醇提物低剂量组（600 mg·kg-1）、川芎水提物高剂量组（1 200 mg·kg-1）、川芎水提物低剂量组（600 mg·kg-1）。连续灌胃给药14 d。

2.3 ISO诱导的大鼠心肌缺血模型建立 参照Karthick等[11]的方法，通过前期对ISO给药剂量的考察，稍作改动建立心肌缺血模型。除空白组外其余各组于第13天、第14天，皮下注射ISO 40 mg·kg-1，每天1次，连续注射2 d进行模型制备。空白组注射等体积的生理盐水，实验期间大鼠自由饮水和进食。在第14天给药1 h后，随即用水合氯醛腹腔注射麻醉，将电极分别插入大鼠四肢皮下，监测注射ISO后20 min内Ⅱ导联心电图变化。判定大鼠阳性心肌缺血标准为（出现以下指征之一者）：①J点偏移大于0.1 mV；②T波高耸，超过同导联R波的1/2；③T波高耸伴J点移位[12]。

2.4 心脏指数测定 实验结束后处死大鼠，快速摘取心脏，用生理盐水洗净，再用滤纸吸干多余水分，称取心脏质量，心脏质量除以大鼠体质量，计算各组大鼠心脏指数。

2.5 生化指标检测 测完心电图后，经腹主动脉取血5 mL，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清冷冻保存。严格按照试剂盒说明书操作步骤，分别测定各组大鼠血清中CK，LDH，AST，SOD，MDA和T-AOC等生化指标。

2.6 心肌组织病理学观察 取心肌组织，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，苏木素-伊红（HE） 染色，光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织病理学变化。

2.7 Western blot 法测定心肌Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表达 取心脏组织，加入含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA细胞裂解液低温研磨，充分裂解，于4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白变性处理后，取等量总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，然后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭。再加入稀释后的Nrf2，NQO1和HO-1抗体，4 ℃孵育过夜，TBST液洗涤3次，每次10 min。加入相应稀释后的二抗，室温孵育4 h，TBST液洗膜3次，每次10 min。用ECL化学发光法检测各组大鼠蛋白表达情况。endprint

2.8 统计学分析 实验数据采用SPSS 16.0统计学软件分析，计量资料用±s表示。首先进行数据正态性检验；然后多组间计量资料比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane′s T2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 川芎提取物对心肌缺血大鼠心脏指数的影响 与空白组相比，模型组大鼠心脏明显水肿，心外膜可见部分灰白色区域，大鼠心脏质量与体质量比值即心脏指数明显升高（P<0.01）。与模型组相比，盐酸地尔硫卓组显著降低心肌缺血大鼠心脏指数（P<0.01）；川芎醇提物与水提物高、低剂量组均能降低心脏指数，改善心肌缺血大鼠心肌水肿程度（P<0.05或P<0.01）。与川芎水提物同剂量组相比，川芎醇提物组减轻心肌水肿效果更为显著（P<0.01），见图1。

3.2 川芎提取物对心肌缺血大鼠血清心肌酶的影响 与空白组相比，模型组大鼠血清中CK，LDH和AST含量显著增加（P<0.01）。与模型组比较，盐酸地尔硫卓组大鼠血清中CK，LDH和AST含量显著下降（P<0.01）；川芎醇提物与水提物各剂量组均能减少心肌缺血大鼠血清中CK，LDH和AST的含量（P<0.05或P<0.01），且川芎醇提物组比相同剂量的川芎水提物组效果更为明显（P<0.05或P<0.01），见表1。

3.3 川芎提取物对心肌缺血大鼠氧化应激的影响 与空白组相比，心肌缺血模型组大鼠血清中MDA含量明显升高，SOD与T-AOC活力显著下降（P<0.01）；与模型组比较，盐酸地尔硫卓组大鼠血清中MDA含量明显下降，同时SOD与T-AOC活力明显提高（P<0.01）；川芎各给药组大鼠血清中MDA含量降低，SOD与T-AOC活力也有一定程度的升高（P<0.05或P<0.01），且川芎醇提物组比同剂量的川芎水提物组效果显著（P<0.05或P<0.01），见表2。

3.4 川芎提取物对心肌缺血大鼠心肌组织病理形态的影响 取染色后的心肌组织切片在光镜下观察，见图2。空白组大鼠心肌纤维排列整齐，组织结构完整，细胞核形态正常，间质无水肿和炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌损伤明显，心肌纤维排列紊乱，肌束间隔增宽，并出现广泛性心肌纤维断裂，空泡样变性明显，间质水肿，大量炎性细胞浸润；盐酸地尔硫卓组大鼠大部分心肌纤维排列整齐，局灶性断裂，细胞间隙水肿减轻，间质内偶见部分炎性细胞浸润。川芎醇提物高剂量组大鼠心肌纤维轻度排列紊乱，肌束间隔略增宽，局部少量炎性细胞浸润。川芎醇提物低剂量组与川芎水提物高剂量组大鼠心肌纤维中度紊乱，轻中度空泡样变性，肌束间隔中度增宽，轻度水肿，间质少量炎性细胞浸润。川芎水提物低剂量组大鼠心肌纤维局灶性断裂，空泡样变性明显，间质有明显炎性细胞浸润。

3.5 川芎提取物对心肌缺血大鼠Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表达明显降低（P<0.01）；与模型组相比，各给药组Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表达均增加（P<0.05或P<0.01），其中川芎醇提物组比相同剂量的川芎水提物组增加明显（P<0.05或P<0.01），见图3。

4 讨论

心肌缺血损伤是多种心血管疾病的始动因素和主要病理特征，与临床上心绞痛、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、血管痉挛等病症的发生发展密切相关。心肌缺血损伤发生机制较为复杂，现代研究表明氧化应激反应是其发生的关键环节之一。正常生理条件下，心肌组织的氧化与抗氧化系统处于动态平衡 状态，ROS生成较少，维持基础水平；病理状态下，心肌缺血的过程中，平衡被打破，ROS大量产生，组织抗氧化能力下降，引起脂質、蛋白质和核酸的过氧化，使细胞膜结构遭到破坏、蛋白变性、DNA链断裂，最终导致心肌细胞损伤、凋亡或坏死[2]。因此，靶向减少ROS水平的抗氧化干预措施将有效延缓和预防心肌缺血损伤。

在本研究中采用皮下注射异丙肾上腺素诱导心肌缺血的病理过程。异丙肾上腺素作为β-受体激动剂，能够通过收缩冠状动脉、增加心肌收缩力、加快心率等环节，造成心肌耗氧量增加，心脏负荷过重，心肌微循环障碍，冠状动脉痉挛，心肌梗死样变化等，进而诱发心肌缺血。SOD是机体清除ROS抗氧化防御系统中重要酶，它可清除超氧阴离子，保护心肌组织免受自由基损伤，其活性能够反映机体的抗氧化储备功能状态[13]。MDA为ROS与细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反映的终产物，其含量可以间接反映脂质过氧化程度[14]。T-AOC代表机体抗氧化物的总体水平，可以综合反映心肌组织的清除ROS的能力。本研究发现心肌缺血模型组血清SOD与T-AOC活力显著下降，MDA含量明显增加，说明氧化应激参与了心肌缺血的病理过程，与文献报道结果相一致[15]。川芎各提取物组均可显著抑制大鼠血清SOD，T-AOC活性的下降和MDA含量的升高，且川芎醇提物组比水提物组效果显著，提示川芎各提取物能有效减轻异丙肾上腺素所致心肌缺血大鼠氧化应激损伤，川芎醇提物抗氧化作用强于水提物。

Nrf2通路是近年来发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，在氧化应激反应应答中起到枢纽的作用，且在心血管系统中分布广泛，与改善心肌缺血损伤密切相关[16]。通常其发挥抗氧化作用方式有：一方面，氧化应激可促进Nrf2 mRNA转录，使得Nrf2蛋白合成增加；另一方面，当机体受到亲电子物质，ROS或者上游信号通路刺激时，Nrf2与其伴侣蛋白Keap1 解离，Nrf2被激活，使得由细胞质转移至细胞核中的Nrf2增加，继而与肌腱纤维瘤蛋白以异二聚体形式与抗氧化反应元件（antioxidant response elements，ARE） 结合，然后通过上调下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因NQO1和HO-1等的表达减轻氧化应激损伤[17-18]。本研究显示异丙肾上腺素诱导的心肌缺血氧化损伤过程中，Nrf2，NQO1，HO-1蛋白水平显著下调。提示心肌细胞的抗氧化能力下降，导致自由基代谢失衡，引起心肌损伤。但与模型组相比，川芎各提取物组Nrf2，NQO1，HO-1蛋白水平均有不同程度升高，川芎醇提物比水提物更为明显，考虑川芎提取物能够激活Nrf2，促进 Nrf2 蛋白的合成和核转位，上调下游NQO1，HO-1 基因表达及蛋白合成，发挥抗心肌缺血损伤的作用。endprint

川芎作为临床常用的活血化瘀药，现代科学研究已经证实川芎及其活性成分可以有效预防和治疗心肌缺血损伤[19-21]。本研究同样表明，川芎提取物对大鼠心肌缺血损伤具有一定程度的保护作用，且川芎醇提物比水提物药效更为显著，可以明显降低心肌指数，减少心肌酶CK，LDH及AST的泄漏，减轻心肌组织形态结构的损伤，同时提高血清中SOD与T-AOC活力，减少MDA含量。进一步研究发现川芎提取物预处理后，可增加Nrf2表达，激活下游抗氧化基因NQO1，HO-1的表达从而减轻心肌缺血氧化应激损伤，提示Nrf2信号通路在川芎提取物对心肌缺血损伤的保护中发挥着重要作用，这为川芎在临床上的合理应用提供了宝贵的科学实验依据。

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[责任编辑 张宁宁]endprint