基于部分酸水解—亲水作用—LC—MS的北沙参多糖结构表征

杜宝香+相美容+付业佩+蒋海强+巩丽丽+容蓉

[摘要] 由于中药多糖结构复杂、相对分子质量大，难以表征，该研究以中药北沙参40%乙醇沉淀多糖（Glehniae Radix polysaccharides， RGP）为研究对象，应用“自下而上”法完成对RGP的结构表征。该文最初采用部分酸水解方法水解RGP，分别考察了酸浓度、水解时间和温度对其水解效率的影响。在最佳条件（1.5 mol·L-1 TFA， 4 h， 80 ℃）下，RGP被水解为特征性寡糖片段。之后，采用HILIC-LC-MS对RGP部分酸水解产物进行分离和结构表征。同时结合几种标准二糖的MS和MS/MS分析，建立依靠质谱分析确定多糖糖苷键类型的方法。结果确定了4种糖苷键连接类型在MS/MS中的断裂规律，并发现RGP为含有1， 4-糖苷键的线性葡聚糖，水解得到聚合度4～11的葡寡糖。

[关键词] 部分酸水解； 质谱； 亲水作用色谱； 北沙参多糖

[Abstract] Water-soluble polysaccharides from traditional Chinese medicine have properties of complex structure and high molecular， resulting in hardly complete their structural characterization.However， a "bottom-up" approach could solve this problem.Glehniae Radix extract was extracted with hot water and then precipitated by 40% ethanol to obtain Glehniae Radix polysaccharides （RGP）. Subsequently， a partial acid hydrolysis method was carried out and the effects of acid concentration， time and temperature on hydrolysis were investigated. Under the optimum hydrolysis condition （1.5 mol·L-1 trifluoroacetic acid， 4 h， and 80 ℃）， RGP were hydrolyzed to characteristic oligosaccharide fragments. Futher， a hydrophilic liquid chromatography- mass spectrometry method was used for the separation and structural characterization of the polysaccharide hydrolysates. According to MS and MS/MS analysis of several standard disaccharides， a method for determining the type of polysaccharide glycosidic linkage by mass spectrometry was established. The results showed that the polysaccharide hydrolysates were linear glucan containing 1， 4-glycosidic bonds. And gluco-oligosaccharides with the degrees of polymerization （DP） of 4-11 were obtained after partial acid hydrolysis.

[Key words] partial acid hydrolysis； mass spectrometry； hydrophilic liquid chromatography； Glehniae Radix polysaccharides

北沙參Glehniae Radix为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidtex Miq的干燥根。味甘、微苦、性微寒，归肺、胃经，有养阴清肺、益胃生津的功效[1]。研究表明，北沙参主要含有挥发油类、香豆素类及糖类等成分[2]，作为北沙参的主要成分之一，北沙参总糖量达70%以上[3]，在调节机体免疫、消除自由基以及抗癌抗肿瘤等[4-5]方面发挥着重大作用。

多糖的活性与其单糖组成、相对分子质量、糖苷键位置及构型等因素相关。可采用光谱及色谱方法分析中药多糖的结构特点，进而对其进行表征[6]。获取结构信息是表征多糖的有效手段，但此过程复杂、繁琐、需要耗费大量精力。因此，有必要发展一种简洁、省时的方法用于中药多糖的表征。

北沙参40%乙醇沉淀多糖（Glehniae Radix polysaccharides，RGP）为混合杂多糖，受蛋白质组学“自下而上”法的启示，对于结构复杂、难以表征的大分子物质，可先将其拆分成相对分子质量较小的片段，通过对各片段结构的分析，进而完成对该物质的表征。本文首先采用部分酸水解方法将RGP降解为特征性寡糖片段，之后，使用亲水作用色谱以及色谱-质谱联用的方法完成对寡糖片段的分离及表征研究，进而获取RGP的组成、连接方式等结构信息。同时研究了不同类型糖苷键在MS/MS分析中的裂解规律。该法可直观反映出多糖成分中糖单元的个数、组成及比例分布等信息。

1 材料

北沙参药材购于山东省济南市百味堂中药饮片有限公司（批号140301，山东莱阳），经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为伞形科植物珊瑚菜G.littoralis的干燥根。三氟乙酸（TFA，纯度> 99.0%），购于天津市光复精细化工研究所；实验用水购自广州屈臣氏有限公司；乙腈、甲酸（色谱纯）购自Fisher Scientific（美国Thermo Fisher Scientific公司）。endprint

Agilent 1260 系列高效液相色谱仪（配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、Agilent G4260B蒸发光散射检测器（ELSD），美国Agilent公司）；Q Exactive 型质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；UltiMate 3000高相液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 RGP的制备

取北沙参药材1 000 g，粉碎，加入6倍体积的80%乙醇回流提取2次，每次2 h，抽滤，药渣自然晾干至无醇味。取药渣500 g，按照工艺优化中的最佳提取工艺[7]：加入25倍量蒸馏水，94.9 ℃条件下浸提2次，每次2 h，过滤，离心，上清液浓缩至600 mL，得北沙参多糖热水浸提液。加入适量的无水乙醇，用酒精计测量乙醇浓度，控制在40%，于4 ℃冰箱静置24 h，抽滤得沉淀，分别用少量无水乙醇和丙酮洗涤2～3次，冷冻干燥，得RGP。

2.2 RGP部分酸水解条件的优化[8]

称取10 mg RGP于具塞试管中，分别考察水解时间、温度及酸浓度对水解程度的影响。

水解时间分别设为1，2，3，4，5 h（TFA浓度为1.5 mol·L-1，温度为80 ℃）；水解温度分别设为30，40，60，80，100 ℃（TFA浓度为1.5 mol·L-1，时间为4 h）；酸浓度分别设为0.5，1，1.5，2，2.5 mol·L-1（温度为80 ℃，时间为4 h），水解液氮气吹干，用2 mL乙腈-水（50∶50）溶液溶解，过0.22 μm滤膜，供HILIC HPLC-ELSD分析。

2.3 分析条件

2.3.1 HILIC HPLC-ELSD分析条件 色谱柱为Agilent HILIC柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美国Agilent公司）。流动相A为水，B为乙腈；洗脱梯度0～20 min，85%～75% B；21～28 min，60% B；流速0.3 mL·min-1；柱温室温；进样量3 μL。ELSD参数：漂移管温度70 ℃；雾化器温度60 ℃；增益10；載气氮气；流速1.2 L·min-1。

2.3.2 HILIC LC-MS联用条件 色谱柱Agilent HILIC柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美国Agilent公司）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；洗脱梯度0～ 20 min，80%～60% B，20～25 min，60% B；流速0.2 mL·min-1；负离子模式；毛细管电压3.2 kV；鞘气流30 arb；辅助气流10 arb；质谱扫描范围m/z 150～2 000；毛细管温度300 ℃；MS/MS裂解电压为50，60，70 V。

2.4 样品溶液的测定

取2.2项不同水解条件下的样品溶液，按照2.3.1项色谱条件分析，用于水解条件的优化选择。

根据优化后的水解条件，制备RGP水解溶液，按照2.3.2项条件进行HILIC LC-MS 分析；取4种二糖（海藻糖、蜜二糖、纤维二糖、蔗糖）适量，加入乙腈-水（50∶50）溶解，配成一定浓度的对照品溶液，按照2.3.2项条件进行HILIC LC-MS分析，用于建立不同糖苷键连接类型二糖在质谱中的断裂规律。

3 结果与讨论

3.1 北沙参多糖部分酸水解方法的建立

使用“热水浸提、乙醇沉淀”法对北沙参药材进行处理，得北沙参40%乙醇沉淀多糖RGP。为得到北沙参特征性寡糖片段，对于影响水解过程的水解时间、温度以及酸浓度进行了深入研究。

水解之后的多糖采用HILIC HPLC-ELSD进行分析。结果表明，RGP在HILIC色谱柱上得到较好的分离，根据分子量由小到大顺序依次被洗脱出来。不同温度下RGP的水解情况，前2 min色谱峰为水解出的单糖及一些杂质，2～8 min为寡糖成分，26 min左右为未被水解的北沙参多糖，见图1。30 ℃时，由于温度较低，水解不够充分，大多数以多糖形式存在；80 ℃时，RGP全部水解成单糖及寡糖；当温度增至100 ℃，多糖水解程度随之增加，寡糖几乎全都水解为单糖物质。因此，为得到特征性寡糖片段，最佳水解温度设为80 ℃。

以各寡糖峰峰面积之和为评价指标，对水解时间及酸浓度进行分析，见图2，3。随着水解时间和酸浓度的增加，寡糖含量均先上升后降低。水解开始时，大分子多糖迅速水解为寡糖，寡糖含量急剧升高；随着水解程度的增加，部分寡糖水解为分子量更小的单糖，其含量开始降低。为得到较高含量的特征性寡糖，分别取4 h，1.5 mol·L-1为最佳水解时间和酸浓度。

3.2 4种标准二糖的HILIC-MS和MS/MS分析

选择4种结构确定的二糖：海藻糖、蜜二糖、纤维二糖、蔗糖分别代表4种不同糖苷键类型。4种二糖的相对分子质量均为342，因此它们在MS分析时没有差异，但对于不同糖苷键链接的寡糖，在MS/MS分析时，具有不同的断裂规律及质量丢失不同。4种二糖的MS/MS图显示1，1-糖苷键的海藻糖在MS/MS中出现m/z 323，221，179，161的碎片质谱峰，分别为母离子341丢失18，120，162，180形成的碎片，其中18为H2O的失去，162为糖残基（C6H10O5）丢失，180（C6H12O6）为丢失162之后再丢失1分子的H2O。其他二糖的MS/MS中除上述外，还有其他质量丢失，见表1。

综合4种二糖在负离子模式下的MS/MS分析结果发现：①糖苷键连接位点的不同会导致相对质量丢失的不同，见表1；②除从结构上直接断裂导致的相对质量丢失（162，120，90，60，30），同时存在脱水所导致的相对质量丢失（18，78，180 ）；③糖残基能完整断裂说明其断裂位置一定为非1C位的糖苷键位点，见图4。endprint

3.3 RGP HILIC LC-MS及MS/MS表征方法的建立

北沙参多糖经过部分酸水解后得到大量特征性寡糖片段，采用HILIC LC-MS在负离子模式下对其进行分析，寡糖片段的总离子流图（TIC）见图5。对图5质谱数据进行分析可知，2 min前为杂质峰，包括单糖、二糖及提取物中其他杂质，寡糖在2～10 min按聚合度由低到高依次出现，色谱峰1～8对应寡糖1～8的相对分子质量分别为666，828，990，1 152，1 314，1 476，1 638，1 800。结合相关文献[8]分析，色谱峰1～8依次为聚合度（DP）4～11的中性葡寡糖，因此，本文提取得到的RGP主要被水解为聚合度4～11的葡寡糖。

以聚合度为6的寡糖（色谱峰3）为例，其在负离子模式下的MS/MS信息见图6，对其二级质谱规律进行分析见图7。以[M-H]-为母离子，丢失葡萄糖残基（162）形成一系列C型碎片，m/z 179（C1），341（C2），503（C3），665（C4），827（C5）。一系列完整的C型碎片证明寡糖结构为线性[9]。同时，[M-H]-发生开环断裂，丢失120，形成一些列2，4A型碎片，m/z 221（2，4A2），383（2，4A3），545（2，4A4）， 707（2，4A5），869（2，4A6）；或者丢失78，即丢失60的同时丢失一分子水，形成一系列0，2A-H2O（B）型碎片，m/z 263（B2），425（B3），587（B4），749（B5），911（B6）。此外，在各寡糖的二级质谱图内均出现了m/z 341，323，281，263，221，179，161的碎片离子质谱峰，其断裂规律符合1，4-糖苷键，故推测RGP可能为含有1，4-糖苷鍵的线性葡寡糖。

4 结论

本研究借鉴蛋白质组学“自下而上”的方法，完成了对RGP的表征，直观反映了多糖成分中糖单元的结构、种类等信息。同时采用HILIC LC-MS联用的方法研究不同糖苷键二糖在MS/MS分析时的断裂规律。结果表明，提取得到的RGP水解后得到聚合度4～11的葡寡糖，为含有1，4-糖苷键的线性葡寡糖；发现了不同糖苷键二糖在MS/MS分析时的断裂规律，建立了依靠质谱分析快速明确糖苷键类型的方法。

本研究存在许多不足之处：糖类物质因为组成和单位结构的特殊性，其同分异构体现象非常普遍，单单依靠质谱检测难以对糖类成分进行定性定量研究，难以确定多糖的具体结构。由于部分酸水解方法的局限性，难以确定多糖中是否存在除1，4-糖苷键以外的其他类型的糖苷键。之后的研究将对北沙参多糖基于不同类型糖苷键水解酶作用下酶解产物的质谱分析。

[参考文献]

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[9] Wang H， Xin H X， Cai J F， et al. Fingerprint profiling of Astragalus polysaccharides based on partial acid hydrolysis and comprehensive quality evaluation of Astragalus membranaceus combined with reversed-phase liquid chromatography finger print analysis[J]. Chin J Chromatogr， 2016， 34（7）：726.

[责任编辑 丁广治]endprint