基于毒性视角考察水飞雄黄的质量情况及其影响因素

姜腊+徐焕华+江珍红+杨诗涵+史巧莉+马增春+高月+陈志武

[摘要] 對收集到的市售3个生产厂家的水飞雄黄采用HPLC-ICP-MS分析其砷的形态及不同形态砷的含量。结果发现，3家企业游离As（Ⅲ）均未超过药典限值，但按游离砷[As（Ⅲ）+As（Ⅴ）]的总值计算，1家企业超出药典限值。现有药典游离砷检定方法为古蔡氏检砷法，存在一定局限性，未能有效规避三价砷以外的其余价态砷伴生的毒性风险。随后考察了水分和温度对水飞雄黄中可溶性砷的含量及形态的影响。结果表明：①水分对水飞雄黄中可溶性砷的含量有显著影响，随着水分的含量的增加，可溶性砷的含量呈上升趋势，形态未发生改变，仅有As（Ⅲ）和As（Ⅴ）；②单纯性的温度因素，样品中可溶性砷的含量变化存在增多趋势，最大增量分别是As（Ⅲ） 2.489 mg·g-1，As（Ⅴ） 0.546 mg·g-1；③当水分与温度共同作用时，样品中可溶性砷的增加量发生显著变化，最大增量分别是As（Ⅲ） 23.690 mg·g-1，As（Ⅴ） 0.468 mg·g-1。综合分析认为：雄黄质量容易受到水分和温度的影响，单纯的水分，以及水分和温度共同作用均能显著改变雄黄中可溶性砷的含量，水分为高危因素。现行《中国药典》2015年版中游离砷的检测方法存在局限性，新的技术应当被引进；于此同时，现行药典中雄黄药材项下未设置水分检查项，应当补足。

[关键词] 雄黄； 水分； 温度； 可溶性砷； 质量研究

[Abstract] The results of a toxicity analysis showed differences from those of the existing experimental data. Therefore， HPLC-ICP-MS was used to analyze the soluble arsenic content at different valences in realgar prepared with water grind processing， which were collected from 3 companies. The results showed that the free arsenic of the 3 companies did not exceed the limit of Chinese Pharmacopoeia. However， if the free arsenic was calculated based on the total value of As（Ⅲ） + As（Ⅴ）， free arsenic of 1 company exceeded the limit of Chinese Pharmacopoeia. The method of determining free arsenic in Chinese Pharmacopoeia. was ancient Cai′s arsenic detection method， which had a certain limitation and failed to effectively avoid the toxicity of remaining arsenics except for trivalent arsenic. Then， we examined the effects of water and temperature on the content and form of soluble arsenic in realgar. The results showed that the content of soluble arsenic increased with the rise of water content， and the form of soluble arsenic did not change， there were only As （Ⅲ） and As （Ⅴ）； With the simple temperature factor， there was an increasing trend in the content of soluble arsenic in the samples， the maximum increment was As （Ⅲ） 2.489 mg·g-1 and As （Ⅴ） 0.546 mg·g-1； When water and temperature played an synergistic effect， the increase of soluble arsenic in the samples significantly changed， the maximum increment was As （Ⅲ） 23.690 mg·g-1， As （Ⅴ） 0.468 mg·g-1， respectively. Through comprehensive analysis， we believed that the quality of realgar was susceptible to water content and temperature. Both of the single effect of water content and the synergistic effect of water and temperature can significantly change the content of soluble arsenic in realgar， and the water content was a high-risk factor. In the current Chinese Pharmacopoeia 2015 version， the free arsenic detection method had limitations， hence new techniques shall be introduced； At the same time， realgar does not have a water content inspection item in the current pharmacopoeia， which shall be added. However， due to the limit of water content， more in-depth studies are required.endprint

[Key words] realgar； water content； temperature； soluble arsenic； quality control

笔者对复方黄黛片方中各组分配伍毒性研究结果进行分析时发现，雄黄单用组LD50与已有研究[1]报道的LD50（20 500 mg·kg-1）相差显著。进一步分析显示，本研究使用的雄黄中可溶性砷达27.777 mg·g-1[其中As（Ⅲ）=21.968 mg·g-1，As（Ⅴ）=5.809 mg·g-1]，为参考文献的16.38倍[1]，亦超过药典对雄黄中三氧化二砷的限定值（7.020 mg·g-1） [2]。然而本研究中使用的雄黄与上述文献中使用的为同一批号，其毒性結果却差异巨大，提示雄黄在其生产之后的节点中存在易于改变其质量的影响因素。

目前所发表的文献中，雄黄的质量研究大多数聚焦于晶型[3]、主成分含量[4]、炮制方法[5]、重金属杂质[6]等，较少关注可溶性砷的形态及含量。质量控制主要关注生产过程，容易忽视生产之后的节点，如运输、储藏、临床应用等。质量检测方法也较为落后，如《中国药典》2015年版使用的古蔡氏检砷法、多数研究中使用的原子荧光法[7]，这2种方法存在不能准确定量以及不能区分砷形态等缺点。而先进的砷形态分析法[8]HPLC-ICP-MS却尚未普及[9-10]。

基于上述现状及事实，作者拟对收集到的市售3家企业的水飞雄黄的质量进行研究，并初步探究其影响因素。期望能提示使用水飞雄黄的科研人员注意关注其本身质量，并指导临床的合理用药，规避因药物质量因素引起的不良反应的发生。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（Agilent），7700x型电感耦合等离子体质谱仪（Agilent. USA），Dionex Ionpac AS19 阴离子交换柱（4 mm ×250 mm，10 μm，Thermo Fisher. USA），DHG 9240型干燥箱（北京陆希科技），高速离心机（Beckman Coulter，Inc. USA），Milliplus 2150超纯水处理系统（Millipore USA）。

1.2 药材及试剂

水飞雄黄（收集到3家企业，在此文章中分别以A，B，C企业代替）；色谱级乙腈、甲醇（Thermo Fisher. USA）；亚砷酸根离子As（Ⅲ） （GBW08666）、砷酸根离子As（Ⅴ） （GBW08667）、一甲基砷MMA（Ⅴ） （GBW08668）、二甲基砷DMA（Ⅴ） （GBW08669）、砷甜菜碱AsB （GBW08670）等砷标准物质均购自中国计量科学院；水为超纯水，电阻率18.2 MΩ·cm，背景检测无干扰；其余试剂均为优级纯。

2 方法

2.1 干燥失重法测定样品含水量

精密称取水飞雄黄1.000 g，置于干燥至恒重的扁形称量瓶中，按《中国药典》2015版一部附录Ⅸ G干燥失重测定法测定。

2.2 市售样品中可溶性砷形态分析及其含量测定

2.2.1 样品前处理 精密称取水飞雄黄1.000 g，加入超纯水50 mL，振摇提取4～6次，合并提取液，500 mL量瓶定容、稀释至所需浓度，0.22 μm滤膜过滤上机测定。

2.2.2 HPLC-ICP-MS测定不同形态砷的含量 本研究中砷形态分析及含量测定的工作由军事医学科学院野战输血研究所血液药理研究室药物代谢重点实验室帮助完成，测定方法参考文献[9]。

2.3 水分对水飞雄黄中可溶性砷的影响

实验执行前，去除水飞雄黄样品中的可溶性砷，作为对照。可溶性砷去除方法：称取水飞雄黄适量，加入超纯水50 mL，振摇、离心、去上清，重复4～6次，最后一次，抽滤，得滤渣烘干即得。实验方案见表1。

实验执行前，对2组样本中的水分和可溶性砷含量进行质控。密封，放置于常温，分别于7，14，28 d取样测定。

2.4 温度对水飞雄黄中可溶性砷的影响

样品前处理同2.3项下，温度对水飞雄黄中可溶性砷的影响实验方案见表2。样品密封，放置于4 ℃、常温、60 ℃环境，分别于7，14，28 d取样测定。

2.5 温度与水分共同作用对水飞雄黄中可溶性砷的影响

样品前处理同2.3项下，实验方案见表3。样品密封，按实验方案放置，分别于7，14，28 d取样测定。

2.6 数据统计

实验数据用±s表示，采用SAS 8.1软件2因素析因设计的方差分析进行组间比较，采用Graphpad prism软件作图。

3 结果

3.1 市售的3批样品中水分及可溶性砷的含量

3批次样品，游离砷含量检查均符合《中国药典》2015年版中古蔡氏检砷法的规定，见表4。As（Ⅲ）的质量分数均低于7.02 mg·g-1，但若以As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的总和计算，批次为2的样品中游离砷的含量超出药典限度。与此同时，按照2015年版《中国药典》对雄黄中主成分硫化砷的检查结果表明，硫化砷质量分数均在药典规定的不小于90%的范围内。

3.2 各影响因素下，雄黄中可溶性砷的含量变化

3.2.1 水分对雄黄中可溶性砷的影响 样品中可溶性As（Ⅲ）的增加量与样品中水分的含量呈正相关趋势，见图1，可溶性As（Ⅴ）数据虽出现波动，但总体趋势依然为正相关。且在时间维度上，随着取样时间的延长，可溶性As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的增加趋势更为显著。为排除样品本身携带的可溶性砷的影响，以实验开始前已去除可溶性砷的样品作为对照，趋势重现性良好。

3.2.2 温度对雄黄中可溶性砷的影响 单纯的温度因素影响下，样品中可溶性As（Ⅲ）的含量变化存在增多趋势，见图2，最大增量为60 ℃、28 d、未去除可溶性砷的样本，其As（Ⅲ）增加的量为2.489 mg·g-1。As（Ⅴ）含量变化趋势一致，最大增量为0.546 mg·g-1。endprint

3.2.3 温度和水分共同作用对雄黄中可溶性砷的影响 在温度和水分的共同作用下，样品中可溶性As（Ⅲ）的含量随着取样时间的延长而剧增，见图3，最大增量为为60 ℃、 28 d、去除可溶性砷的样本，其As（Ⅲ）的增量为23.690 mg·g-1。与单纯的温度或水分作用相比，数值变化具有显著性差异。As（V）含量变化也显升高趋势，最大增量为0.468 mg·g-1，与单纯的温度或水分作用相比，数值变化没有显著性差异。

4 讨论与建议

中药安全性的评价存在诸多难点，如中药成分复杂、毒性机制复杂、中药作用多途径、配伍应用多样性、中药效应多靶点、毒理效应综合性[11-12]，如何克服这些难点，探清中药作用的物质基础、毒性机制是中药安全性评价目前面临的一大困境。而药材基原清楚、质量可控是安全性评价的大前提，考虑到雄黄为确有疗效的有毒中药，特别是随着砷剂在白血病及肿瘤方面的优越疗效。其安全性已受到国内外学者的普遍关注。而全面的安全性评价是雄黄走向国际市场的基础，为更好的评价其安全性，雄黄的质量控制研究势在必行。

最新文献表明，雄黄中的可溶性砷，特别是As（Ⅲ），既是雄黄发挥疗效的物质基础，也是产生毒性的物质基础[13]，可溶性砷在雄黄中扮演着毒效一体的角色。现代医学鼻祖、希腊医生巴拉塞尔萨斯有一句名言：“万物皆有毒，关键在剂量”。因此控制雄黄中可溶性砷的含量是安全应用雄黄的前提。

在本研究中，考察了水分和温度2个因素对雄黄中可溶性砷含量的影响，结果表明水分和温度均能引起可溶性砷含量的变化，且水分是高危因素。雄黄中随着水分的增加，可溶性砷的含量显著上升，且高温能催化这一现象。但现行《中国药典》2015年版中，雄黄药材项下缺失水分检查项目，可能带来安全隐患。基于目前，仅考察了收集到的3批雄黄样本，尚不能合理的制定水分的限值，这也是本研究的局限性，此部分还需要更广泛、更深入的后续研究。研究结果虽然能推论出水分越低，雄黄的质量越稳定，但质量的稳定并不一定能带来最大的疗效收益，因为效和毒的物质基础均为可溶性砷As（Ⅲ）。在此前提下，认为直接标示药材中含有的可溶性砷的形态以及各形态砷的准确含量不失为一个更好的解决方案。

因此建议：①更新药典标准，引入HPLC-ICP-MS分析技术监控雄黄中可溶性砷的含量，并关联分析砷的形态；②雄黄的药典标准中，补充“水分检查”项目，控制水分；③临床使用前，若能动态監控，及时根据雄黄中可溶性砷的含量调整雄黄的给药剂量，并警示雄黄可能的毒性危害，监测患者血液中可溶性砷的形态及浓度。笔者期望不仅能避免雄黄可能的毒性危害，更期望能促进雄黄在全球范围内的广泛接受和使用。雄黄，以毒为能、毒效并存，可控的质量是其被接受的前提，也是其生命线。

[参考文献]

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[13] Griffin. Blood′s 70th anniversary： arsenic—from poison pill to magic bullet [J].Blood， 2016，127 （14）， 1729.

[责任编辑 孔晶晶]endprint