枳椇子品质与产地和外观性状相关性分析

刘聪+吴加梁+赵娜+孙健+沈晓霞+王志安

[摘要] 应用HPLC和紫外分光光度计测定了26份不同产地的枳椇子Hovenia acerba中二氢杨梅素和总黄酮的含量，并进一步探讨了枳椇子品质指标二氢杨梅素和总黄酮与产地、外观性状的相关性。结果表明，不同来源的枳椇子品质差异较大，二氢杨梅素质量分数为0.41～9.81 mg·g-1；总黄酮质量分数为5.52～21.98 mg·g-1。聚类分析表明，枳椇子品质与局部产区来源有相关性，鄂北皖南的江汉平原地区枳椇子质量相对稳定，区域内枳椇子样品质量较优。相关性分析表明，千粒重和红黑籽粒的比例与二氢杨梅素的含量极显著正相关；而总黄酮含量与千粒重以及红黑籽粒比例无相关关系，千粒重和红黑籽粒的比例可做为初步判定枳椇子品质优劣的指标。另外，二氢杨梅素含量与总黄酮含量无相关关系，考察枳椇子品质时应兼顾两者。

[关键词] 枳椇子； HPLC； 品质； 外观； 产地

[Abstract] The contents of dihydromyricetin and total flavonoids of Hovenia acerba seeds were detected by HPLC-DAD and UV spectrophotometer. And then the correlation between the habitat， phenotype and quality of H. acerba seeds were deeply studied. There were big differences in both appearance and quality among the H. acerba seeds from different places. It showed that the content of dihydromyricetin in H. acerba seeds was 0.41-9.81 mg·g-1， and the content of total flavonoids was 5.52-21.98 mg·g-1. The cluster analysis showed that the quality of H. acerba seeds was related to the habitat. The samples from Jianghan Plain Area showed relatively stable and excellent quality. According to the correlation analysis， there was a significant positive correlation between 1 000-seeds weight， red-black seeds ratio and the content of dihydromyricetin， while the content of total flavonoids was not related to the 1 000-seeds weight and red-black seeds ratio. So the 1 000-seeds weight and red-black seeds ratio could be used as an initial judgment of the quality of H. acerba seeds. As dihydromyricetin and total flavonoids content was not related， both dihydromyricetin and total flavonoids should be taken into account when the quality of H. acerba seeds was studied.

[Key words] Hovenia acerba； HPLC； quality； phenotype； habitat

枳椇子主要為鼠李科枳椇属Hovenia Thunnb.植物枳椇H. acerba Lindl.的成熟种子，部分地方炮规中规定北枳椇H. dulcis Thunb.也为枳椇子的植物基源。枳椇子是药食两用药材，其肉质膨大的花序轴成熟后口味甘甜可生食，亦可酿酒、醋；其种子富含油脂和蛋白质，具有一定营养价值[1]。枳椇子性平、味甘，载于《唐本草》、《雷公炮炙论》和《本草纲目》等多部中医药著作中，常用于止渴除烦，清湿热，解酒毒，利二便。现代药理研究表明枳椇子具有解酒护肝，抗炎抗氧化，预防肝纤维化、脂肪肝等病症的作用[2]。枳椇子含有黄酮、皂苷、生物碱、有机酸酯等活性成分[3]。Song等[4]研究表明二氢杨梅素为枳椇子的主要黄酮类化合物，而研究发现枳椇子中二氢杨梅素具有明确的解酒作用[5]，此外二氢杨梅素还具有减轻四氯化碳造成的急性肝损伤的作用[6]，这与古籍中记载枳椇子解酒保肝的功效相契合。因此，本研究选取二氢杨梅素和总黄酮2个指标直接评价枳椇子的品质。

目前，对于枳椇子的研究主要集中在药理药效领域，有关品质和药材基原的研究较少，各地区的炮制规范仅有外观上的描述，认为红棕色为佳。综合考虑枳椇子的产地、外观和有效成分，本文以我国13个省份的26份枳椇子材料为研究对象，统计千粒重和种子颜色组成，测定总黄酮和二氢杨梅素，分析其品质与产地的相关性，为枳椇子质量标准评价提供参考。

1 材料

1.1 样品与试剂

成熟新鲜带有种子、肉质花序轴的枳椇果枝于2016年10—11月采自浙江、湖北、湖南、陕西等13个省份的26个地区（表1），经浙江省中药研究所沈晓霞教授鉴定均为枳椇H.acerba。剥离得到种子，即为枳椇子，置于50 ℃烘12 h至恒重，密封储藏于4 ℃，待用。endprint

主要试剂为二氢杨梅素（批号BCBC8837，纯度≥98%，Sigma）、芦丁（批号K1618018，纯度≥97%，Aladdin）；乙腈色谱纯（TEDIA）；其他无机物药品购自国药集团。

1.2 仪器设备

Agilent高效液相色谱系统（Agilent，1100 series）、色谱柱（Dikma，C18）、紫外分光光度计（Agilent，Cary-60）、恒温水浴锅（晶玻实验仪器公司，HH-6）、离心机（Thermo，Sorvall ST-16）、分析天平（Mettler-Toledo，ML-204）、粉碎机（IKA，A-11）等。

2 方法

2.1 枳椇子质量评价

从外观和有效成分含量2个方面考察枳椇子的品质，分别统计千粒重、枳椇子颜色组成，测定总黄酮含量和二氢杨梅素含量，数据重复3次。

2.2 千粒重的测定

每份材料随机取枳椇子种子20 g，统计种子数量，进而计算枳椇子千粒重。

2.3 枳椇子颜色统计

枳椇子种子一般有红色和暗黑色2种，且2种颜色种子可以着生在同一果枝上。每份材料随机取枳椇子种子100粒，统计不同颜色枳椇子的数量，进而计算红色籽粒和黑色籽粒子的比例。

2.4 供试样品制备

2.4.1 对照品溶液制备 精密称取二氢杨梅素对照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，70%乙醇定容，制得将二氢杨梅素质量浓度为1.00 g·L-1溶液作为标准储备液。精密量取上述标准储备液 1.00 mL，用70%乙醇稀释至10 mL作标准液，其质量浓度为1.0 g·L-1。检测前配置成质量浓度分别为

20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1的梯度对照品溶液。

精密称取经干燥至恒重的芦丁对照品10.00 mg，置于50 mL量瓶中，70%乙醇定容，将芦丁质量分数为0.20 g·L-1溶液作为标准储备液。检测前加入70%乙醇梯度配置成质量浓度分别为10.0，20.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液制备 样品打粉，过药典3号筛。精密称取枳椇子粉末1 000.0 mg，置于平底烧瓶中。精密加入70%乙醇40.0 mL，密塞，称重。加热回流提取2 h，放冷，再称重，以70%乙醇补足失重，超声混匀，取上清液，过滤待用。

2.5 总黄酮的测定

参考易跃能等[7]测定总黄酮的方法，在此方法的基础上，稍加改进。样品制备参考2.4.2项，取1.0 mL提取液，置于10 mL量瓶中，加5% NaNO2 1.0 mL，摇匀，放置6 min；再加10% Al（NO3）3 1.0 mL，摇匀，放置6 min；加4% NaOH 5.0 mL，摇匀，放置15 min；以4 500 r·min-1离心6 min，取上清液，在510 nm波长处测定。标准曲线用芦丁对照品绘制。

2.6 二氢杨梅素的测定

测试样品制备参考2.4.2项，色谱柱Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；进样量10.0 μL；柱温35 ℃；检测波长 290 nm；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫程序为0～10 min，15%～12% A；10～15 min，12%～16% A；15～16 min，16%～90% A；16～18 min，90% A；18～19 min，90%～15% A；19～30 min，15% A。在上述色谱条件下，供试品及对照品溶液的HPLC图谱见图1。

2.7 水分测定

水分含量测定参照 GB/T14489.1-1993，105 ℃恒重法。

2.8 数据分析

应用IBM SPSS 16.0软件进行数据分析。采用类间平均链锁法和选择欧氏距离系数对26份枳椇子产地的地理分布状况和品质组成进行聚类分析。选择Pearson法对枳椇子不同品质指标进行相关性分析。

3 结果

3.1 枳椇子地理产地聚类分析

26份枳椇子材料产地包含了我国枳椇子的主要产区，根据枳椇采集地经纬度聚类分析可知26份枳椇种质分别来自：A东南山区；B横断山脉地区；C秦岭山脉地区；D江汉平原地区；E雪峰山脉地区；F西南和岭南地区六大区域，见图2。

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系考察 精密量取2.4.1项下二氢杨梅素对照品溶液，以2.6项下方法，分别进样，以峰面积（Y），对照品浓度（X），绘制标准曲线，得二氢杨梅素的线性回归方程为Y=23.256X+4.16，R2=0.999 7，线性范围 20.0～100 mg·L-1，表明在此范围内数据线性关系良好。

精密量取2.4.1项下芦丁对照品溶液，以2.5项下方法测定，以吸光度（Y），对照品浓度（X），得线性回归方程为：Y=0.013 9X-0.003 8，R2=0.999 8，线性范围为10.0～100.0 mg·L-1，表明在此范围内数据线性关系良好。

3.2.2 精密度试验 分别取20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1二氢杨梅素对照品，以2.6项下方法，重复进样3次，记录二氢杨梅素标准液的峰面积，计算RSD在0.04～0.38%，表明仪器精密度良好。

分别取10.0，20.0，60.0，80.0，100.0 mg·L-1芦丁对照品，以2.5项下方法，分别重复测定3次，RSD为0.23%～0.78%，表明仪器精密度良好。

3.2.3 重复性试验 取同一供试品溶液6份，以2.6项下方法测定，并记录样品中二氢杨梅素的峰面积，计算RSD 0.39%，表明该方法重复性好。endprint

取同一供试品溶液，以2.5项下方法，平行测定6份溶液，并记录样品中总黄酮的吸光度，RSD 1.0%，表明该方法重复性好。

3.2.4 稳定性试验 取同一供试品溶液1.0 mL，以2.6项下方法，分别在0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 h下测定，并记录样品中二氢杨梅素的峰面积，计算RSD为0.59%，表明供试品溶液在常温下15 h内稳定。

取同一供试品溶液，以2.5项下方法，分别在0，10，15，20，30 min测定样品吸光度，RSD为0.67%，表明该方法测定值在常温下加入显示剂后30 min内稳定。

3.2.5 加样回收率 取同一供试品溶液，按原有量的80%，100%，120%加入二氢杨梅素对照品溶液，以2.6项下方法测定，记录二氢杨梅素峰面积，计算平均回收率为95.78%，RSD 0.010%，表明该方法符合含量测定的基本要求。

取同一供试品溶液，按原有量的80%，100%，120%加入芦丁对照品，以2.5项下方法，测定6份溶液，平均回收率为100.1%，RSD为0.59%，表明该方法符合含量测定的基本要求。

3.3 枳椇子品质

不同地区来源的枳椇子的大小、颜色外观、总黄酮含量和二氢杨梅素含量差异较大，见表1。枳椇子千粒重一般大于15 g，主要分布于15～25 g，见图3A。四川雅安和四川攀枝花2份枳椇子全部呈现土黄色，不同于其他地区的枳椇子，红色籽粒和黑色籽粒比值一般小于5，少数种质如河南信阳和浙江衢州的枳椇黑色籽粒较少，见图3B。枳椇子总黄酮质量分数集中于12～18 mg·g-1的芦丁当量，26份枳椇的总黄酮含量接近二项分布，见图3C，该结果与姚小华等研究结果一致[8]。大部分枳椇子二氢杨梅素的质量分数低于4.0 mg·g-1，信阳的枳椇二氢杨梅素含量表现突出，质量分数高达9.81 mg·g-1，见图3D。

相关性分析可知二氢杨梅素含量与千粒重和红黑粒比例2项指标极显著正相关（P<0.01），Pearson相关系数分别为0.733，0.560。而二氢杨梅素含量、千粒重和红黑粒比例均与总黄酮不相关，见表2。攀枝花和雅安2份枳椇子的颜色全部为土黄色，该表型与其他材料明显不同，可能是川南枳椇居群的遗传调控决定，这2组材料不参与红黑粒比例与枳椇子品质的相关关系分析。

以总黄酮和二氢杨梅素为品质参考指标，26份枳椇子可聚成4大类，结果见图4。陕西省枳椇主要聚在Ⅰ类，该组总黄酮含量较高，质量分数大于16.00 mg·g-1，但二氢杨梅素的含量比较低，质量分数均小于4.00 mg·g-1；浙江枳椇主要聚在Ⅲ 类，该组总黄酮含量较低，但二氢杨梅素的含量比较高，质量分数2～6 mg·g-1；江汉平原的襄阳和信阳2份枳椇子单独聚为一组，该组枳椇的各项品质

指标均较优；四川攀枝花的枳椇材料黄酮含量很低，籽粒也偏小，呈土黄色，与其他地域来源的枳椇显著不同，单独聚为Ⅳ类。

结合品质值聚类结果，在收集材料的地理划分基础上将品质指标较特殊的攀枝花数据剔除，湖北宜昌地区数据归到西南山区的E组，获得不同地理产区枳椇子品质变异分析见表3。

4 讨论

4.1 枳椇子品质与产地

本研究中枳椇子采集时间和前处理条件一致，采集样本为的某一地区的枳椇子混合样品，反映了 某一地区药材生物居群的整体状况，因此造成不同地域枳椇子品质差异的原因主要为基因型差异和生长环境差异。

对比图2，4可以看出，同一产区的枳椇子样本按品质指标数据聚类基本可以聚在一起，该结果说明枳椇子的产区分布和品质特征具有相关性，即虽然枳椇子产区分布较广，但是存在品质较优的枳椇子产区。

由表3数据可知，不同产区的枳椇子品质总体差异较大，以浙江和福建为代表的东部产区（A组）、陕南主产区（C组）和汉中主产区（D组）的枳椇子二氢杨梅素含量较西南地区（E组和F组）高出约50%；同时，东部产区枳椇子的总黄酮含量明显低于其他产区。部分产区内部样本品质差异性较大，如东部产区；局部产地的枳椇子品质相对稳定，如陕南产区和江汉平原产区。然而限于统计样本较小，产区划分较大，该组数据仅初步反映了不同产区的枳椇子的品质指标的差异性和稳定性。依据本实验结果，应进一步扩大江汉平原产区的样本量，进而明确我国品质优异，且功效成分含量稳定性较好的枳椇子产区。

4.2 枳椇子有效成分与表观特性

中药材品质控制和分析一直以来是中医药事业发展的重点和难点，目前中药材的品质评价以有效成分的测定为主[9]。然而外观品质鉴别具有检测成本低，操作快捷的特点，是中药材品质优劣、真伪辨别的经典方法[10]，也是现代中药材品质评价的重要组成部分。本文证明千粒重大，红黑籽粒比例大的枳椇子与功效成分——二氢杨梅素的含量显著正相关，说明这2个表观性状可以作为枳椇子品质初步判定的参考指标。

[参考文献]

[1] 于修烛， 杜双奎， 李志西， 等.枳椇子理化特性及营养成分分析[J]. 中国粮油学报， 2011，26（8）： 62.

[2] 时涛， 王晓玲， 陈振德，等.枳椇子化学成分及其药理活性研究进展[J]. 中药材， 2006，29（5）： 510.

[3] 沙美， 丁林生， 枳椇子的化学成分研究[J]. 中国药科大学学报， 2001，32（6）： 418.

[4] Song M， Gao M H， Huang W H， et al. Flavonoids from the seeds of Hovenia acerba and their in vitro antiviral activity[J]. J Pharmaceut Biomed，2016，6（6）：401.

[5] Shen Y， Lindemeyer A K， Gonzalez C， et al. Dihydromyricetin as a novel anti-alcohol intoxication medication[J]. J Neurosci， 2012，32（1）：390.

[6] Xie J， Liu J， Chen T M， et al. Dihydromyricetin alleviates carbon tetrachloride-induced acute liver injury via JNK-dependent mechanism in mice[J]. World J Gastroentero， 2015，21（18）：5473.

[7] 易跃能， 杨华， 赵勇， 等. 渗漉法提取广枣中黄酮类成分的工艺研究[J]. 中国中药杂志， 2010，35（14）：1806.

[8] 姚小華， 高英， 李卫民，等. 枳椇子中总黄酮的含量测定[J]. 辽宁中医药大学学报， 2008， 10（5）：151.

[9] 张铁军， 中药质量认识与质量评价[J]. 中草药， 2011，42（1）： 1.

[10] 张学慧， 徐国文. 中药材的经验鉴别[J]. 中国民族民间医药， 2009， 18（4）：111.

[责任编辑 吕冬梅]endprint