银杏二萜内酯葡胺注射液对大鼠局灶性脑缺血的保护作用

罗燕平+张红+胡晗绯+曹泽彧+张新庄+曹亮+王振中+萧伟

[摘要] 探討银杏二萜内酯葡胺注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（MCAO）的保护作用，并探讨其可能的作用机制。雄性SD大鼠140只，随机分为假手术组、模型组、银杏提取物注射液（金纳多，1.0 mL·kg-1）、尼莫地平注射液（0.2 mg·kg-1）组、银杏二萜内酯葡胺注射液（5.2，2.6，1.3 mg·kg-1）组；所有动物手术前4 d尾静脉注射给药（模型组及假手术组给予生理盐水）。除假手术组，其他动物通过右侧大脑中动脉线栓塞法（MCAO）制作局灶性脑缺血再灌注模型。缺血3 h 后，所用动物再次尾静脉注射给药。大鼠缺血再灌注后进行神经行为学评分并采用TTC染色法观察脑组织梗死率；测定脑组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、乳酸（LA）含量及脑脊液中 Ca2+，谷氨酸（Glu），天冬氨酸（Asp）以及磷酸肌酸激酶（CK-BB）和乳酸脱氢酶（LDH）含量的变化。与假手术组相比，模型组大鼠脑梗死率显著增加，神经严重缺损；脑组织匀浆中MDA、LA含量升高，GSH、SOD含量降低；脑脊液中Ca2+浓度降低，Glu和Asp的含量及CK-BB、LDH含量显著升高。与模型组相比，银杏二萜内酯葡胺注射液高、中剂量组能显著减少脑梗死率，改善脑神经功能缺损症状；提高 SOD、GSH活性，减少血清中MDA、LA含量；升高脑脊液中Ca2+浓度，减低神经递质Glu和Asp的含量及CK-BB、LDH的含量。银杏二萜内酯葡胺注射液能明显改善模型动物的神经功能缺损，其机制可能与修复血脑屏障，减少自由基，减少细胞外游离钙内流，降低脑脊液中兴奋性氨基酸含量等有关，从而保护脑缺血。

[关键词] 银杏二萜内酯葡胺注射液； 脑缺血再灌注； 超氧化物歧化酶； 神经递质； 钙离子

[Abstract] To investigate the protective effects of ginkgo diterpene lactone meglumine injection （GDLMI） on cerebral focal ischemia reperfusion injury induced by middle cerebral artery occlusion （MCAO） in rats， and explore its possible mechanism. One hundred and forty male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， ginkgo biloba extract injection （Ginaton， 1.0 mL·kg-1） group， nimodipine （0.4 mg·kg-1） group， and GDLMI （5.2， 2.6， 1.3 mg·kg-1） groups； All of rats received corresponding drugs by tail vein injection 4 days before operation （normal saline in model group and sham operation group）. Except the sham operation group， the cerebral ischemic stroke model was established by MCAO method in right brain of the other rats. After 3 h of ischemia， all the animals received intravenous administration again. The neurobehavioral scores of rats after ischemia-reperfusion were evaluated and the infarct rate of brain tissue was observed by TTC staining. The super oxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and lactic acid （LA） contents in brain tissue homogenate and the concentration of Ca2+， glutamate （Glu） and aspartate （Asp）， creatine phosphate kinase （CK-BB） and lactate dehydrogenase （LDH） content changes in cerebrospinal fluid were measured. As compared with the sham operation group， the cerebral infarction rate was increased significantly in the model group； the content of MDA and LA in the homogenate of brain tissue was increased， and the content of GSH and SOD was decreased； in cerebrospinal fluid， Ca2+ concentration was decreased， and the content of Glu and Asp， CK-BB and LDH increased significantly. As compared with the model group， the high and medium dose GDLMI groups can significantly reduce the cerebral infarction rate and improve the symptoms of neurological impairment； increase SOD and GSH activity， reduce MDA and LA content in serum； increase Ca2+ concentration in cerebrospinal fluid and decrease the content of neurotransmitter Glu and Asp as well as CK-BB and LDH. GDLMI could obviously improve neurologic impairment in model rats， and the mechanism may be related to recovering the blood brain barrier， scavenging free radicals， decreasing free Ca2+ inflow into the cells and the content of excitatory amino acid in cerebrospinal fluid to improve its protective effect on cerebral ischemia.endprint

[Key words] ginkgo diterpene lactone meglumine injection； cerebral ischemia reperfusion injury； super oxide dismutase； neurotransmitter； Ca2+

据统计，我国约有7 000万脑卒中患者，其中缺血性脑卒中约占70%。缺血性脑卒中具有复发率高（17.7%），致残率高（33.3%～44.6%），病死率高（11.4%～15.4%）的特点[1]。临床上治疗缺血性脑卒中的药物主要为抗血小板药物，如阿司匹林、氯吡格雷；该类药物长期服用存在出血风险，并易产生抵抗作用；临床联合用药发现，将抗血小板药物与神经保护药物联用，可显著改善缺血性脑卒中患者的神经功能缺损症状[2]。开发一种既能抗血小板又能改善神经功能，且出血风险低的药物具有较好的应用前景。

银杏内酯是银杏叶中一类重要的成分，主要含有倍半萜内酯和二萜内酯[3]；已鉴定的二萜内酯类化合物有银杏二萜内酯 A，B，C，J，K，L，M，N，P，Q 等。前期药理研究报道，银杏中二萜内酯类化合物具有较好的抗血小板聚集、抗炎、保护心脑血管的活性[4-5]，可有效预防治疗心脑血管疾病[6]。基于此，采取现代提取富集工艺从银杏叶中制备出了以二萜内酯为主要成分的原料药，随后开展了系列的药理作用研究，以探讨银杏二萜内酯治疗局灶性脑缺血的作用。

1 材料

1.1 药品与试剂

银杏二萜内酯葡胺注射液（江苏康缘药业股份有限公司，批号000409）；银杏叶提取物注射液（金纳多注射液，德国威玛舒培博士药厂，批号6580199，7.5 mg银杏提取物 5 mL/支）；尼莫地平注射液（德国拜尔出品，批号 CATEZ1），水合氯醛 （国药集团化学试剂有限公司，批号20000609），氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma 公司，批号 122016），丙二醛测定试剂盒（MDA），批号20000715；超氧化物歧化酶测定试剂盒（SOD），批号20000705；谷胱甘肽测定试剂盒（GSH），批号20000721；乳酸测定试剂盒（LA），批号20000705；考马斯亮蓝剂盒，批号20000825；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，批号20000515，磷酸肌酸激酶 （CK-BB） 试剂盒，批号20000524，钙（Ca2+）试剂盒，批号20000625；均由南京建成生物工程研究所提供。其他试剂均为市售分析纯。

1.2 动物

SD大鼠，雄性，SPF级，6月龄，体质量300～400 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证号 SCXK（沪）2008-0016。动物饲养于屏障环境中，12/12 h 明暗交替，温度为22～25 ℃，相对湿度50%～60%，动物自由进食饮水，适应5 d后开始试验。

1.3 仪器

TSQ-280 型恒温培养振荡器（上海精宏实验设备有限公司），DHG-9053A 型电热恒温干燥箱（上海医用恒温设备厂），AU600 型全自动生化分析仪（日本 Olympus公司），Agilent1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），5804R型冷冻离心机（Eppendorf公司），BS224S 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）

2 方法

2.1 分组与给药

大鼠随机分为7组：假手术组、模型组、金纳多注射液（1.0 mL·kg-1）、尼莫地平注射液（0.2 mg·kg-1）组、银杏二萜内酯葡胺注射液（5.2，2.6，1.3 mg·kg-1）组，每组20只；造模前4 d，每天尾静脉注射给药1次，最后一次给药30 min后进行脑缺血造模，再灌注后注射相同的药物；假手术组和模型组于相同时段注射等体积生理盐水。

2.2 模型制備

参考Longa等的方法[7]，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。大鼠用10%水合三氯乙醛（300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰卧恒温手术台上颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线（长4 cm，直径0.26 mm）经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进20 mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。1 h后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌注模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。

2.3 检测指标

2.3.1 行为学评分 术后24 h按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，提尾悬空离地面约 35 cm，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察两侧抵抗力的差异。标准如下：0级，未观察到神经症状；1级，提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；2级，将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；3级，动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；4级，软瘫，肢体无自发活动[8]。

2.3.2 TTC染色法观察大鼠脑梗死率 MCAO 24 h后，断头处死大鼠，取出全脑，左右脑分别切开，称重。在右脑视交叉及其前后各2 mm处，做冠状切，脑切片于1%TTC溶液中避光37 ℃孵育25 min，用眼科镊分离苍白区（梗死区）和非苍白区（正常区），计算梗死百分比[9]。

梗死率=苍白区质量/（苍白区质量+非苍白区质量）×100%endprint

将染色后的脑组织置于110 ℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下。

脑组织含水量=（1-脑组织干重/脑组织湿重）×100%

2.3.3 脑组织匀浆中SOD，GSH，MDA，LA量的检测 缺血再灌注24 h后，大鼠断头处死，取脑，去除小脑。将大脑用生理盐水制成10%匀浆，按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书，测定大脑组织中的超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）和乳酸（LA）含量。脑匀浆蛋白含量按考马斯亮蓝法测定[10]。

2.3.4 脑脊液中氨基酸类神经递质Glu和Asp 及Ca2+，CK-BB，LDH 测定 再灌注 24 h 后，大鼠以10%水合氯醛麻醉，剪开背面颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉，暴露枕骨大孔。将大鼠头向腹面弯曲，用 1 mL 一次性注射器轻轻刺穿脑膜，抽取脑脊液约 100 μL。所得脑脊液以1 000 r·min-1离心3 min，取上清液，超滤杯过滤离心（8 000 r·min-1离心5 min）后待用。取过滤后的脑脊液样品 10 μL，行柱前衍生化反应并HPLC分析Glu和Asp。Ca2+，CK-BB，LDH 的测定严格按照各试剂盒操作要求进行测定[11]。

2.4 统计学方法

实验数据以±s表示，SPSS 17.0统计软件进行分析，多组间均数采用One-way ANOVA法检测显著性，P<0.05差异显著。

3 结果

3.1 MCAO 大鼠的神经行为学评分及脑血管梗死率和脑含水量的影响

缺血再灌注后，与假手术组相比，模型组神经行为评分、脑梗死率及脑含水量均有显著性差异（P<0.01）；与模型组相比，银杏二萜内酯葡胺注射液高、中剂量及金纳多注射液、尼莫地平注射液均能降低神经行为评分、脑梗死范围以及脑含水量 （P<0.05），见表1。

3.2 对 MCAO大鼠血清生化指标的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清中的MDA，LA含量显著增加，SOD，GSH含量显著减少（P<0.01）；与模型组相比，银杏二萜内酯注射液高、中剂量组及金纳多注射液组、尼莫地平注射液组大鼠血清中的MDA，LA含量显著减少，SOD，GSH含量显著增加（P<0.01）；低剂量组效果未见显著性差异，见表2。

3.3 对MCAO大鼠脑脊液指标的影响

与假手术组相比，模型组大鼠脑脊液中Ca2+含量显著低于假手术组（P<0.01）；LDH含量及

CK-BB，Glu，Asp活性均显著高于假手术组（P<0.01）。与模型组相比，银杏二萜内酯注射液高、中、低3个剂量组，金纳多注射液，尼莫地平注射液均可显著提高大鼠脑脊液Ca2+的含量（P<0.05），显著降低神经递质Glu和Asp 含量及CK-BB，LDH的含量（P<0.05），见表3。

4 讨论

脑缺血再灌注造成的损伤病理及生理过程极为复杂，脑中血流中断导致局部脑组织处于缺血缺氧状态，细胞能量代谢发生紊乱[12]。缺血再灌注后使脑组织细胞发生损伤级联放大效应，包括能量代谢障碍、生成自由基[13]、激活凋亡基因、炎症反应、细胞内Ca2+稳态失衡等，最终诱发细胞凋亡[14-15]。本研究结果显示银杏二萜内酯注射液可使局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤的脑组织内的MDA，LA等含量降低，表明组织缺血缺氧和过氧化程度受到明显抑制；同时SOD和GSH含量增加，反映了药物对机体抗氧化能力和清除自由基的能力有提高。

脑缺血再灌注过程中，局部脑组织可通过神经元突触或者胞体与脑脊液发生信息交流，因此脑脊液中相关成分变化能够在一定程度上反映脑组织的损伤情况。Glu、Asp、甘氨酸等氨基酸为中枢神经系统中传递兴奋性的主要神经递质，过度释放兴奋性氨基酸并激活相应受体将导致兴奋性神经毒性，可在较大程度上影响脑缺血再灌注损伤的预后[16]。本研究结果显示大鼠缺血再灌注24 h后，脑脊液中Glu，Asp 含量显著增高；而银杏二萜内酯葡胺注射液及其主要成分作用之后，能有效降低脑脊液中兴奋性氨基酸的含量，表明银杏二萜內酯葡胺注射液能修复脑内的因缺血引起的氨基酸动态平衡失调。

在正常情况下，机体神经元通过控制细胞膜对Ca2+通透性来维持钙离子的内外平衡。脑缺血再灌注过程中细胞膜通透性发生改变，使细胞内Ca2+高于正常水平，导致脑组织受伤[17-18]。细胞内钙浓度的异常升高可诱发Ca2+依赖性的谷氨酸持续释放，Glu的过度释放可引发神经细胞凋亡的级联反应[19]。本研究检测了缺血再灌注动物模型给药前后脑脊液中 Ca2+浓度的变化，发现模型组脑脊液中Ca2+浓度显著低于假手术组，可能与Ca2+向细胞内流有关。银杏二萜内酯葡胺注射液能在一定程度上升高脑脊液中Ca2+含量，表明其可能通过改善离子转运，从而减少缺血再灌注引起的Ca 2+浓度失衡。

CK一种是由B和M型2个亚单位组成的二聚体同工酶。脑组织中主要是CK-BB，正常情况下，CK-BB 在血液及脑脊液中含量极低。脑组织发生损伤时，脑细胞膜通透性增加，CK-BB 被释放入细胞间隙，并通过受损的血脑屏障进入血液，故CK-BB在血及脑脊液中的含量变化可反映脑细胞受损的严重程度[20]。正常情况下LDH 只能在脑细胞的胞浆中检测到，当脑破损时可从脑细胞溢出，使腦脊液中的LDH酶浓度升高。因此当脑脊液中LDH，CK-BB酶浓度发生变化表明脑组织受到了损伤，且与浓度呈正相关。本实验结果表明银杏二萜内酯葡胺注射液可降低大鼠脑脊液中磷酸肌酸激酶和乳酸脱氢酶的含量。

本研究表明银杏二萜内酯葡胺注射液可显著降低局灶性脑缺血再灌注后大鼠脑组织的梗死范围和含水量，改善其神经行为。脑组织匀浆生化指标检测发现该药能显著降低脑组织中MDA，LA含量，升高GSH，SOD含量。提高模型大鼠脑脊液中 Ca2+，并降低CK-BB，LDH的含量及神经递质 Glu 和 Asp含量。表明该药对大鼠实验性局灶性脑缺血有显著的保护作用。作用机制可能与其修复血脑屏障、改善离子转运，减少急性脑缺血后细胞内钙超载和兴奋性氨基酸的释放，从而阻断一系列脑损伤瀑布效应，延迟神经元死亡，改善模型动物的神经功能缺损，发挥对脑缺血的保护作用。endprint

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[责任编辑 孔晶晶]endprint