银杏二萜内酯A B K抗血小板聚集作用机制研究

王奎龙+李卓琼+曹泽彧+柯志鹏+曹亮+王振中+萧伟

[摘要] 为研究银杏二萜内酯A，B，K（GA，GB，GK）对家兔血小板聚集功能的影响，比较三者作用机制的异同及强弱，该研究采用体外实验法，观察不同剂量GA，GB，GK对血小板活化因子（PAF）诱导家兔血小板聚集作用的影响。研究结果显示，3种银杏二萜内酯均可抑制PAF诱导的体外家兔血小板聚集，其强弱顺序为GK>GB>GA；三者还能够拮抗[3H]PAF与PAF受体的特异性结合，拮抗能力同样为GK>GB>GA。进一步研究三者对于PAF诱导后血小板中胞内[Ca2+]i动员及胞内 cAMP水平的变化，发现三者均能够剂量依赖性的抑制胞内[Ca2+]i动员并提高胞内cAMP水平，且它们的作用强弱与拮抗PAF受体能力的强弱一致。表明银杏二萜内酯GK对于PAF受体具有高度的选择性，并能够通过激活cAMP信号通路、抑制胞内[Ca2+]i动员的方式达到抑制血小板聚集的目的，GB、GA对PAF受体也有较强的拮抗作用，但弱于GK。

[关键词] 银杏二萜内酯A； 银杏二萜内酯B； 银杏二萜内酯K； 血小板聚集； 血小板活化因子（PAF）

[Abstract] To investigate the effects of ginkgolide A （GA）， ginkgolide B （GB） and ginkgolide K （GK） on platelet aggregation in rabbits， and compare the similarities and differences among these three components. The effects of different doses of ginkgolide A， B and K on platelet aggregation induced by platelet activating factor （PAF） were observed by using in vitro experiment. The results showed that three compounds could inhibit platelet aggregation induced by PAF in vitro， and the intensity was GK>GB>GA. It was further found that all of them can mobilize [Ca2+]i and enhance intracellular c-AMP level in a dose-dependent manner， which was consistent to the ability to antagonize PAF receptor. These findings indicated that GK was highly selective for PAF receptor， and may inhibit platelet aggregation by activating cAMP signaling pathway and inhibiting intracellular [Ca2+]i mobilization； GB and GA also had strong antagonism to PAF receptor， but the effect was weaker than that of GK.

[Key words] ginkgolide A； ginkgolide B； ginkgolide K； platelet aggregation； platelet activating factor （PAF）

缺血性脑卒中是危害全球的疾病，具有高致残、高致死率，且复发率高，严重危害人类健康。目前临床对于缺血性脑卒中的治疗从机制上可以分为溶栓和抗血小板，前者如重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogenactivator，rt-PA），但该类制剂也存在治疗时间窗窄（4.5 h内）、不良反应严重等问题，因而通过其获益的患者不足3%。所以目前市场上对于脑卒中的治疗，抗血小板药仍占据重要地位，加强对该类药物的研究具有广阔的前景[1-3]。

银杏二萜内酯葡胺注射液属于中药五类新药，具有活血通络之功效，临床用于脑梗死（中风病中经络痰瘀阻络证）的治疗，症见半身不遂、口舌歪斜、言语謇涩、肢体麻木等。其成分明确，主要由银杏二萜内酯A（ginkgolide A，GA）、银杏二萜内酯B（ginkgolide B，GB）、 银杏二萜內酯K（ginkgolide K，GK）组成。目前对于银杏二萜内酯B的研究已经比较深入，GB是目前已知天然产物中活性最强的PAF受体拮抗剂之一[4-5]。作为与GB结构母核相同的GA和GK，是否具有相同的作用特点，三者的作用强度又如何？为此，本文研究了三者对于PAF诱导家兔血小板聚集作用的影响及特异性拮抗PAF与PAF受体结合的强弱，并比较了三者对于PAF诱导后血小板内[Ga]2+i动员和cAMP水平的影响，以期探讨3种银杏二萜内酯拮抗血小板聚集作用机制的异同，阐明银杏二萜内酯葡胺注射液治疗脑梗死的作用机制。

1 材料

1.1 药物 银杏二萜内酯A（ginkgolide A，GA），白色针晶，纯度>98%，分子式C20H24O9，江苏康缘药业股份有限公司提供；银杏二萜内酯B（ginkgolide B，GB），白色粉末，纯度>98%，分子式C20H24O10，江苏康缘药业股份有限公司提供；银杏二萜内酯K（ginkgolide K，GK），白色粉末，纯度>98%，分子式C22H20O12，江苏康缘药业股份有限公司提供。

1.2 试剂 血小板活化因子（PAF）（Sigma-Aldrich，批号BCBM4010V），枸橼酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号20120921），Fluo-4 NW染料（Molecular Probes TM，批号F36206），cAMP ELISA 试剂盒购（R&D Systems，批号20121526），DMSO（Sigma，批号20128756），[3H]PAF（American Radiolabeled Chemicals Inc，ART1599），甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号20160426），甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20121127）。endprint

1.3 实验动物 健康新西兰兔6只，体质量2.0～2.5 kg，雄性（由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号SCXK（苏）2012-0008，质量合格证号201311283）。

1.4 仪器 SC2000血小板聚集分析仪（北京赛科希德科技发展有限公司）；LD4-1.2台式自动平衡离心机，（北京京立离心机有限公司）；METTLER-XL205电子天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司），EnSPire 2300多功能酶标仪（Multilabel Plate Reader，PerkinElmer，USA），红外线快速干燥器RQ-305型（上海云被电工电讯器材厂），液体闪烁计数仪（Wallac GUARDIAN 1414 Liquid scintillation counter）。

2 方法

2.1 溶液的配制 将血小板活化因子（PAF）溶解于0.9%生理盐水中，使其终浓度分别为1 mg·L-1；枸橼酸钠溶于蒸馏水中，质量浓度为4%。

2.2 家兔体外血小板聚集实验 取雄性新西兰兔6只，利多卡因局部麻醉，颈动脉插管取血，枸橼酸钠（4%） 1∶9 抗凝，以800 r·min-1离心10 min，取上清液，该上清液为富血小板血浆（PRP），剩余部分以3 000 r·min-1离心15 min，取上清液为贫血小板血浆（PPP），将PPP 加入到PRP 中，使PRP 含有的血小板数目在4×108 个/mL。聚集诱导剂用PAF（1 mg·L-1）。每管260 μL PRP 中加入不同浓度生理盐水稀释的药物30 μL（DMSO终浓度不超过0.1%），对照组PRP中加入生理盐水30 μL（含0.1%DMSO），同时设立生理盐水组（30 μL，不含DMSO），温育5 min，然后加入10 μL诱导剂，观察5 min内血小板聚集情况并记录最大（MAX）血小板聚集率[3]。并按下述公式计算抑制率，血小板聚集抑制率=（对照组血小板聚集率-给药组血小板聚集率）/对照组血小板聚集率×100%。以药物浓度自然对数为横坐标，抑制率为纵坐标，建立相关方程，通过方程计算抑制率为50%时的药物浓度，即半数抑制浓度（inhibitory concentration 50，IC50）。

2.3 银杏二萜内酯A，B，K对PAF与PAF受体结合的特异性拮抗作用 参考文献研究方法[4]，调整血小板数为4×108 个/mL，每个反应孔中加入[3H]PAF（终浓度为2.02×10-4 nmol·L-1），非特异性结合孔中加入未标记的PAF（终浓度为3.69×103 nmol·L-1），竞争性结合孔中加入不同浓度的化合物GA，GB，GK（9.425×10-5，9.425×10-4，9.425×10-3，9.425×10-2，9.425×10-1，9.425，9.425×101，9.425×102 nmol·L-1，每个浓度设立3个复孔），总结合孔和非特异性结合孔中加入空白溶剂，室温下反应10 min后，玻璃纤维滤膜抽滤，用2 mL含0.1%BSA的0.9%Nacl冲洗液冲洗3次，滤膜在红外灯下烘干，置2 mL二甲苯闪烁液中，测量放射强度，并计算得到特异性结合放射强度，录入数据，采用SPSS软件One Site Competition，拟合标准曲线，求出IC50及Ki值，实验重复3次。

2.4 家兔体外血小板胞内[Ca2+] i动员实验 按照试剂盒说明配制染料溶液，将PRP（4×10 8个/mL）用Fluo-4 NW染料溶液稀释100倍，然后加入96孔板中，每孔100 μL，置37 ℃孵育 30 min后，加入5 μL不同浓度样品（0.01% DMSO助溶，用试剂盒中缓冲液配制3个化合物样品使得终浓度为2 μmol·L-1），并分为静息组和激活态组（激活态组加入PAF，终质量浓度0.033 mg·L-1，静息组不加入PAF），采用EnSPire 2300多功能酶标仪在 37 ℃下检测胞内Ca2+荧光强度，发射波长为516 nm，激发波长为494 nm，通过平均荧光强度比较钙释放率。

2.5 环核苷酸分析 制备PRP后，调整血小板密度为4×108 个/mL，与Ca2+动员实验相同，设立静息组与激活态组，静息组将40 μL PRP与5 μL 3种银杏二萜内酯样品及5 μL 生理盐水37 ℃孵育5 min后，加入10 mmol·L-1 EDTA终止反应；激活态组将生理盐水改为PAF溶液，終止反应后用PBS洗涤3次，之后于-80 ℃冻存，37 ℃解冻，重复3次（24 h/次），血小板悬浮液4 000×g在4 ℃离心20 min，上清液留作ELISA试剂盒测定[6-7]。

2.6 统计学分析 所有数据用±s表示。先用单因素方差分析（One-way ANOVA），再用Dunnett′s或Tukey′s多重比较法与对照组比较各组数据。统计显著性水平P<0.01及P<0.05。

3 结果

3.1 银杏二萜内酯A，B，K体外给药对家兔血小板聚集率的影响 研究结果表明，生理盐水组与对照组相比无显著性差异，说明DMSO不会引起血小板的聚集，可以用作药物的溶剂。GA，GB，GK对PAF诱导的家兔体外血小板聚集具有有显著的抑制作用，并呈现出剂量依赖关系，结果见表1，其中GK对于PAF的拮抗作用最强，IC50为0.5 μmol·L-1，GB（IC50=0.64 μmol·L-1）次之，GA（IC50=2.54 μmol·L-1）的作用最弱。研究结果表明3种银杏二萜内酯与PAF受体的亲和力较强，为进一步证实该结果，本实验测定了三者与PAF受体的结合力。

3.2 银杏二萜内酯A，B，K对PAF与PAF受体结合的特异性拮抗作用 实验方法参考文献[4]并进行重复，求得Kd为0.016 542 nmol·L-1，由此可计算，GK的Ki=6.47×10-3 nmol·L-1，见表2，为三者之中最小，且比GB小1个数量级，而GB比GA小1个数量级，说明GK拮抗PAF受体的能力远强于GB和GA，此结果与三者拮抗PAF诱导的血小板聚集结果一致，见图1，表明三者对家兔血小板膜上的PAF受体具有较高的亲和力，其强弱顺序为GK>GB>GA。endprint

3.3 GA，GB，GK对家兔体外血小板胞内[Ca2+]i动员的影响 GA，GB，GK对处于静息态的血小板胞内[Ca2+]i无明显影响，见图2；经PAF刺激后，胞内[Ca2+]i荧光强度显著增加，但在预先给予GA，GB，GK的组别中，可以观察到，相比于PAF刺激组，三者均能够显著降低胞内[Ga2+]i荧光强度，且其强弱顺序和他们拮抗PAF的结果一致。

3.4 GA，GB，GK对血小板中环核苷酸含量的影响 由结果可知，在静息状态下，当给予GA，GB，GK刺激后，三者均能够明显升高血小板中cAMP的水平；而当静息状态的血小板给予PAF刺激后，血小板中的cAMP水平显著下降，但若在给予PAF的同时加入GA，GB与GK，则三者能够逆转PAF导致的血小板中cAMP水平的下降，并且具有显著性差异，见图3。

4 讨论

缺血性脑卒中又称作脑梗死，是一种常见的神经内科疾病，具有高致残率、高病死率等特点，在我国，脑卒中发病率为（116～219）/10万人[8]。脑组织中局部动脉血流灌注减少或中断，导致局部血栓的形成是诱发脑卒中的重要病因[9]，因而抗血小板药物对于该类疾病治疗具有良好的效果。目前公认的抗血小板药物有阿司匹林和氯吡格雷，它们分别对AA及ADP诱导的血小板聚集具有较好的抑制作用，但该类靶点并非脑卒中过程中的特异性靶点，因而使用不当易导致出血性风险[10-11]。

PAF是迄今所发现最强的血小板聚集诱导剂，是TXA2的200倍，ADP的500倍[12]，它能加速血小板聚集和颗粒释放，增加血管通透性，并参与炎症、血栓和氧化等病理过程，是较好的缺血性脑卒中治疗靶点[13-14]。GB是已发现的天然产物中最强的PAF受体拮抗剂之一，含有GB的制剂对缺血性脑卒中也具有显著的疗效[15-16]。银杏二萜内酯葡胺注射液中具有与GB相同母核的GA和GK，应当具有与GB相似的拮抗PAF受体的作用，但它们各个从成分作用强弱如何，需要进一步探讨。通过抑制家兔体外血小板聚集实验，本研究确认了GA，GB，GK对PAF的拮抗作用，而通过对化合物的比较发现，GK对于PAF受体的拮抗作用最强。为进一步验证三者对PAF受体的拮抗作用，实验还考察了三者与PAF受体的结合力，该结果从物理化学的角度证明GA，GB，GK通过竞争性的结合血小板膜上的PAF受体，抑制PAF与受体的结合，从而抑制血小板的聚集的物理化学基础，不仅如此，其结合力的强弱趋势与前期抗血小板的活性趋势保持一致。综上，本研究进一步丰富了银杏内酯拮抗PAF受体的证据。

前述实验证实了三者对于PAF受体的拮抗作用，为探索三者拮抗PAF受体抑制血小板聚集的作用机制，本实验还研究了三者对于PAF激动前后血小板内游离Ca2+浓度的改变。实验结果表明GA，GB，GK能够抑制PAF诱导的血小板中的[Ca2+]i 释放，但对于静息状态的血小板无明显作用，且GK的拮抗能力最强，说明三者能通过拮抗PAF受体抑制[Ca2+]i释放。[Ca2+]i释放是PAF受体激动后的主要生化事件，其增加后，能够进一步引起磷脂酶A2（PLA2）的激活、血小板形态改变、致密颗粒释放和最终血小板的聚集等一系列级联反应[17]。本研究表明，银杏二萜内酯通過拮抗PAF受体激动，抑制[Ca2+]i释放。不仅如此，3个化合物对[Ca2+]i的抑制趋势与其对血小板聚集的抑制趋势保持一致，其中GK的活性最强。因此，本研究表明，抑制[Ca2+]i释放是银杏二萜内酯通过拮抗PAF受体抑制血小板聚集的重要机制之一。

前人的报道表明，cAMP也是PAF诱导的血小板聚集中的重要信号分子。具体表现为，PAF受体激动后，cAMP含量降低，导致ATP依赖的钙离子通道脱磷酸化，进而促使 [Ca2+]i释放及后续的血小板反应[18-20]。本研究围绕银杏二萜内酯对静息态（无PAF处理）和激活态（PAF处理）下血小板内cAMP含量的影响进行了比较，结果表明银杏二萜内酯可以显著提高激活态血小板内cAMP含量，逆转PAF的作用。银杏二萜内酯对cAMP含量提高的趋势与其对[Ca2+]i释放的抑制趋势保持一致，其中以GK的活性最为明显。此外，本研究还表明，银杏二萜内酯尽管对静息态血小板内cAMP也具有显著的诱导作用，但对[Ca2+]i释放并没有显著影响，这也提示了血小板对Ca2+含量的调节可能还存在cAMP以外的机制。

本研究发现银杏二萜内酯A，B和K通过选择性结合PAF受体，拮抗PAF与PAF受体的结合；在血小板内，它们通过提高受PAF抑制的cAMP水平，进而抑制[Ca2+]i释放及后续的血小板聚集。本研究还发现GK具有比GB更强的拮抗PAF受体的能力，因而含有GK的银杏二萜内酯葡胺注射液可能会发挥出比单体化合物更优的药效。

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