3种抗原修复方法对免疫组化染色效果的影响

郑秋桦，李钰湘，柯 野，张海明

（1.韶关学院英东生命科学学院，广东韶关512005；2.广州安必平医药科技股份有限公司，广东广州510663）

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究.在免疫组织化学的试验过程中，常采用固定石蜡包埋组织，然而组织在使用甲醛固定过程中，形成的醛键会封闭抗原的决定簇，影响抗体和抗原的结合，从而影响染色观察结果；因此，对抗原的修复在免疫组织化学中就尤为重要［1］.不同的抗原修复方法对免疫组化染色结果产生不同的影响［2-3］.如加热抗原修复技术既能保留福尔马林固定石蜡包埋技术良好的组织学形态，又明显提高抗原的检出率，提供良好的IHC染色结果［4-5］；影响加热抗原修复的因素主要包括修复的温度、加热的时间、热源、抗原修复液的pH值等方面［1］.

本文采用控制变量法，探究在改良Tris-EDTA(PH9.0)修复试剂中，采用水煮、微波和高压3种不同的热修复方法对P53、P63、Ki67、CK5/6、CK7这5个抗体的免疫组化染色效果的影响.

1 材料与方法

1.1 试验组织与试剂

1.1.1 试验组织

由广州安必平（LBP）医药科技股份有限公司提供的阳性组织材料.

1.1.2 试验试剂

抗体试剂均由LBP公司提供的即用型产品（见表1）；环保透明脱蜡剂；无水乙醇；过氧化物酶封闭液（3%过氧化氢）；二抗试剂：LBP-VBrightI二抗HRP鼠兔通用型（一步法）；DAB显色液（加强型）：1 mL DAB色原/20 mL DAB缓冲液；改良Tris-EDTA(PH9.0)浓缩液（50×）；Mayer’s苏木素染液；PBS 缓冲粉：2 000 mL/包；Tween-20.

1.1.3 试剂的配制

DAB显色液（加强型）：一滴DAB原液加入至1 mL DAB缓冲液中，该溶液易氧化，现配现用.

Tris-EDTA(pH9.0)修复液：改良Tris-EDTA(pH9.0)浓缩液（50×）40 mL加入1 960 mL的蒸馏水搅拌均匀.

表1 试验所用抗体信息

PBS缓冲液：一包PBS缓冲粉加入蒸馏水2 000 mL搅拌至粉末全部溶解加入4 mL Tween20继续搅拌至完全融合即可.

1.2 试验设备

Thermoscientific切片机、武汉俊杰电子有限公司生物组织摊烤片机、微波炉、Leica DM500显微镜、Leica ICC50 HD Camera、苏泊尔YS20ED 20 cm高压锅.

1.3 方法

1.3.1 组织蜡块的切片与前期处理

将五种组织蜡块-20℃冷冻，2～3 min后取出，打开空气加湿器减少静电作用，在切片机上连续切片（2μm），放入20%的酒精中展片，再使用防脱载玻片进行捞片，保证每张片捞的方向及位置一样且尽可能在载玻片的中央处，以便阅片及效果对比.每个组织块捞9片，在44℃热水中进行摊片使组织与载玻片平整粘附，无褶皱，60℃的烤片机上进行烤片至组织与载玻片较牢固结合，不会由于重力作用而出现移位，将载玻片转至耐高温塑料切片架后，放入烘片机进行55℃烘片2 h.

1.3.2 片子的脱蜡与水化

将已完成初步处理的片子放进通风橱中的环保脱蜡剂（代替二甲苯）中进行脱蜡处理3次，每次10 min，确保脱蜡干净后进行梯度水化，梯度水化为无水乙醇→95%乙醇→90%乙醇，每个梯度水化5 min.1.3.3抗原修复

1.3.3.1 水煮修复法

取2 000 mL修复液于不锈钢锅中，置于电磁炉上加热至沸腾后，放入组织片进行修复，修复时间分别为10 min和20 min.

1.3.3.2 微波修复法

将组织切片放入2 000 mL修复液中置于微波炉中，微波炉高火（功率750 W）加热至沸腾后，调至中火（功率375 W）开始修复，修复时间分别为10 min和20 min，修复后用自来水迅速降至室温.

1.3.3.3 高压修复法

将组织切片完全浸置于修复液中，放入高压锅内0.1 MPa（121℃）分别进行修复2 min、2.5 min、3 min和5 min，修复完后，迅速降压降温至常温常压后进行清洗.

1.3.4 阻断（内源性过氧化物酶的灭活）

立即将修复完后的组织切片进行多次水洗后，置于过氧化物酶封闭液中阻断10min，再进行水洗，然后置于PBS溶液中.

1.3.5 抗体孵育

从PBS溶液中取出组织切片，迅速甩干大量水珠，放于免疫组化湿盒中，快速滴加即用型一抗，23℃孵育30 min后，用PBS溶液冲洗后，置于PBS溶液清洗缸中取出组织切片去掉大部分水份滴加二抗，室温孵育20 min，再用PBS冲洗后浸泡.

1.3.6 DAB显色与苏木素复染

从PBS溶液中取出组织切片，甩干大量水分后，迅速滴加DAB显色液，显色3 min后，吸干大部分显色液后，置于DAB清洗液中多次水洗，然后用Mayer’s苏木素溶液进行复染30 s.

1.3.7 PBS返蓝

将组织切片放进PBS溶液中进行返蓝1 min，返蓝后的苏木素是标记出细胞核的位置，方便观察时做目标区域的参照物，返蓝后多次水洗.

1.3.8 脱水、透明、封片和镜检

将片子放进95%乙醇脱水1min后，分别用无水乙醇脱水2次，每次1 min；将切片架放于环保透明脱蜡剂中脱蜡2次，每次3 min，用中性树胶滴入封片后，标记归类；利用Leica ICC50 HD Camera进行拍照保存，并对染色结果进行评分.

1.4 评分标准

判断评分标准参考文献［6］的方法进行评分.评分方法1：在判断中只考虑阳性细胞所占的百分比，按不同的百分比分级；将阳性细胞百分比分成5级，无阳性细胞为0分，阳性细胞≦25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分.评分方法2：在判断中只考虑阳性细胞的染色程度，按不同的染色强度分级；着色强度无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分［6］.试验中，Ki67 采用方法 1 的评分方法；CK5/6、CK7、P53和P63采用方法2的评分方法.

图1 CK5/6的3种修复方法比较结果图

图2 CK7的3种修复方法比较结果图

2 结果与分析

对5种抗体的3种修复方式，结果分别见图1-5，评分结果见表2.由图1-5和表2可知：5种抗体高压修复的效果均为强表达；微波20 min修复P53和P63均为强表达.CK5/6、CK7和ki67在高压修复较其它两种修复方式有更为理想的染色效果；从节省时间，降低掉片概率及出现背景概率等方面综合考虑，故将Tris-EDTA(pH9.0)高压修复2 min作为最佳修复方式.而P53及P63的微波修复20 min染色强度与高压修复的结果一致，均为强阳性.5种抗体的水煮修复法的染色效果均不理想，主要由于修复液的大量蒸发不但浪费试剂还有可能影响修复液浓度从而导致修复效果不稳定，故不宜使用该方法.微波修复20 min对于部分组织的修复效果可以达到要求，但是微波修复也存在不足，如：长时间的浸泡和机械力容易导致掉片；修复液的大量蒸发浪费试剂，严重时导致干片，抗原失活.综上所述，较佳的修复方式为高压修复2 min.

图3 ki67的3种修复方法比较结果图

图4 P53的3种修复方法比较结果图

3 讨论

免疫组织化学的染色质量受整个试验过程多方面因素的影响，如温度、抗原修复方法、抗体浓度、孵育时间及显色时间等多种因素.抗原修复方法是关键的因素之一.由于采用不同的抗原修复方法，导致免疫组化实验结果差异极大甚至出现假阴性.因此寻找理想的抗原修复方式可提高抗原检出率，提高免疫组化结果的准确性［7］.

图5 P63的3种修复方法比较结果图

表1 3种抗原修复法对免疫组化染色结果的比较

本研究仅对5种抗体采用了3种修复方式的研究，有待一步探究其它的修复方式，以期获得更为直观和方便可行的修复方法.

［1］姚梅宏,郑智勇.免疫组化抗原修复技术新进展[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(5):544-547.

［2］陈余朋,张声,王行富,等.不同的抗原修复方法在Ⅳ型胶原免疫组化染色中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(1):98-100.

［3］宿颖,刘曼,张辛燕.不同抗原修复方法对KLF4在小鼠舌黏膜上皮中表达的比较[J].北京口腔医学，2014,14(6):344-346.

［4］Jagirdar J.Immunohistochemistry:then and now[J].Arch Pathol Lab Med,2008,132(3):323-5.

［5］Shi S R,Taylor C R.Extended application of antigen retrieval technique in immunohistochemistry and in situ hybridization[A].Shi S R，Taylor C R，eds.Antigen retrieval immunohistochemistry based research and diagnostics[C].Hoboken:John Wiley,2010:25-45．

［6］许良中，杨文淘.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229-231.

［7］何新明,顾霞,郭文婷,等.免疫组织化学染色存在的问题及解决方案[J].实用医技杂志,2017,24(8):871-872.