不同条件下离体大鼠肝脏线粒体能量代谢微量热分析

袁莲，刘玉娇，何欢，蒋风雷，李会荣，刘义,＊

1 引言

在自然界中，生命的代谢过程最终是一个放热过程，量热分析是生物分析中的一个重要方法，被广泛用于研究微生物的热量代谢。其实时长期的监测、对数值的精密响应，是其他传统分析方法不能做到的。近年来，微量热法的应用越来越广泛，不仅包括生物大分子相互作用、细菌、酵母、土壤中微生物等的微量热研究，而且已经渗透到我们生活各个领域1-4。

线粒体是能量代谢的重要场所，食物被消化后进入细胞，被分解成所需要的分子，进入线粒体进行三羧酸循环，然后转化成线粒体电子传递链所需要的底物，促进线粒体的呼吸并合成ATP，为生命活动提供能量5。线粒体最重要的功能是通过氧化磷酸化过程来合成 ATP，为生物体提供能量。氧化磷酸化主要在呼吸链(电子传递链)上进行。顾名思义，呼吸链即是呼吸的过程，人体吸入的氧气也是在呼吸链上被还原。线粒体呼吸链由5种不同的蛋白复合物组成，分别是：复合物I、II、III、IV和 V。这些复合物嵌在内膜的磷脂双分子层之间，电子经由这几种复合物及几种游离的电子传递物质依次传递，最终的结果是消耗氧气，生成 ATP。在线粒体中，ATP的生成分为两个阶段。第一个阶段，通过电子传递链的作用，NADH和FADH2提供质子，这创造了内膜两侧的电化学梯度，允许质子跨越内膜。电子的载体(复合物I-V)将电子逐步地从NADH传递到O2。复合物中的三种(I、III、IV)也能运输质子，在传递电子的同时将质子从基质泵出到膜间腔。泵出的质子又创造了内膜两侧的质子梯度。因此，线粒体内膜两侧具有一定的跨膜电势，通常是 150-180 mV，膜间腔侧为正，基质侧为负6。第二个阶段，复合物V即ATP合成酶消耗质子梯度，将质子再运回到基质，并利用势能合成ATP7。然后，ATP通过腺嘌呤核苷酸转运酶(ANT)运输到线粒体外，为细胞提供能量8。线粒体在细胞中的功能非常重要，其功能减退能引起许多疾病，尤其是对能量需求量大的器官和部位，如大脑、心脏和肌肉等9,10。当线粒体功能受到损伤时，例如 Ca2+稳态失调或线粒体Ca2+过载，将会导致活性氧(ROS)的增加，ROS能攻击蛋白、脂质和DNA，造成线粒体功能的进一步损伤，从而线粒体渗透转换孔(MPTP)开放的几率增加，线粒体膜间腔中的细胞色素 c等凋亡因子释放到细胞质中，调控细胞的程序性死亡11。

有文献报道，线粒体将会成为治疗疾病的普遍机制11，基于此，线粒体靶向药物也成为了研究的热点12-16。无论是考察药物的生物安全性，还是考察其对线粒体的结构与功能的影响，仅从个体或细胞层面分析线粒体具有一定的难度，因此体外线粒体的研究是探讨毒理和药理的有效手段之一。线粒体从组织内提取出来后，往往因为其活性时间短而使得对其性质的研究受到限制。常见的体外线粒体研究局限在4 h之内，包括用光谱法检测线粒体的肿胀、膜电位差、膜流动性，用电极法检测线粒体的耗氧速率等17。然而，线粒体是细胞内产能的细胞器，研究药物对其活性影响的长期过程尤为重要。离体线粒体在数小时之后，活性会降低，但是并未完全丧失，传统的方法难以继续研究线粒体的活性变化过程。而且药物对机体的作用往往有一个长时间的积累过程，为了补充体外线粒体实验方法的不足，本论文利用热活性检测仪TAM III考察了长时间内对离体线粒体能量代谢的监控，获得了不同条件下，离体线粒体的功率-时间曲线，并通过计算得到了线粒体能量代谢的热动力学参数。本实验使用了已知的工具药，包括 Ca2+、不同底物、不同缓冲液以及一系列线粒体抑制剂，旨在揭示不同条件下体外线粒体代谢的基本特征，为线粒体的探究提供了方法。

2 实验部分

2.1 试剂和溶液

蔗糖(sucrose)；甘露醇(mannitol)；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)；乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)；3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)；MgCl2；KH2PO4；Na3PO4；CaCl2；KNO3；KCl；KAc；琥珀酸钠(sodium succinate)；丙酮酸钠(sodium pyruvate)；丙二酸钠(sodium malonate)；NaN3，以上药品均为 AR级，购于武汉欣申试化工科技有限公司。鱼藤酮(rotenone)；寡霉素(oligomycin)；缬氨霉素(valinomycin)；环孢菌素A(CsA)，以上药品纯度＞ 99%，购自美国 Sigma公司。实验用水为去离子水。

缓冲溶液的配制：按照表1配方，配制7种缓冲液，调节到相应的pH值。

2.2 线粒体提取

依据细胞中各组分密度不同，本文采用差速离心法提取大鼠肝脏线粒体18。肝脏组织剪碎并在Buffer A中匀浆后，在4 °C条件下离心3 min，离心力为1000 g。取上清液，在10000 g条件下离心4 min，弃去上清液，将沉淀分散于Buffer A中，以同样的条件离心4 min。再将沉淀分散于Buffer B中，以同样的条件离心4 min。最后获得富含线粒体的颗粒，分散于Media C中，置于4 °C冰箱保存。线粒体中蛋白的浓度用双缩脲法测定19，最终富集的蛋白浓度约为50 mg·mL-1。

表1 7种缓冲液的组分Table 1 The components of 7 buffers.

2.3 线粒体能量代谢

新提取的线粒体分散液保存于0 °C冰水浴中8 h，使用TAM III微量热仪30 °C进行实时检测。安瓿瓶中加入线粒体及所需的药物，用 Media C(研究不同缓冲液时除外)补充至总体积为1 mL，压盖密封，按照仪器操作要求进样。安瓿瓶及其他耗材需要提前灭菌，加样过程在无菌环境下进行。

3 结果与讨论

3.1 不同浓度线粒体的能量代谢

从大鼠肝脏中提取出线粒体后，用透射电镜、液相溶氧系统、紫外-可见光谱、荧光光谱等手段对其进行了表征，结果证明提取物为纯度较高、活性强的线粒体17。透射电镜观察到线粒体双层膜完整、嵴清晰可见、电子密度高，说明线粒体结构完整。用罗丹明 123作为荧光染料检测线粒体膜电位，发现25 °C下1 h内线粒体膜电位未降低，说明新提取的线粒体能够维持其膜功能。同时，由于线粒体是有氧呼吸的场所，本文在进行量热实验之前，用液相溶氧系统测量了线粒体的耗氧速率，并计算了呼吸控制率。呼吸控制率是反映线粒体呼吸链酶功能的重要指标，通常活性较好的线粒体，呼吸控制比达到3。本实验中，线粒体的呼吸控制率都大于3，说明线粒体保有良好的耗氧和合成ATP的功能17。然而短时间内对线粒体的检测不足以阐述线粒体的性质，因此本文用微量热法对离体线粒体进行了长期、实时的监测，获得了功率―时间曲线。线粒体代谢是一个指数式产热的过程，生长过程中的产热功率也呈指数式增加，此过程的产热曲线对应于如下方程20：

式中 k是新陈代谢速率常数，t是代谢时间，P0和Pt分别是时间为0和时间为t时的热输出功率。对量热仪所记录的数据 Pt取对数，并以 lnPt对 t进行线性拟合，可以得到线粒体新陈代谢速率常数(k)。当药物或其他物质加入到生物体系时，对生长代谢有一定的影响，生长速率常速 k通常也会发生相应的变化。因此，可以通过 k的变化，来分析药物或其他物质对线粒体活性的影响。除此之外，通过计算还可获得线粒体代谢过程中的其他热动力学参数，包括总热量释放(Q)、最大产热功率(Pmax)和最大产热功率时间(tmax)。

图 1是不同浓度线粒体的产热曲线，线粒体的量热曲线包含一个主峰和一个肩峰。在相同条件下，7.0与3.5 mg protein·mL-1的线粒体，第一个峰位置相同。线粒体浓度越高时，最大产热功率越高，且第二个峰出现更早，说明线粒体含量越多时，代谢速率越快。从表2a中的热动力参数可以看出，高浓度线粒体的代谢速率常数，包括两个热活性增长速率常数 k1、k2和热活性衰减速率常数 k3，都比低浓度时大。虽然高浓度线粒体产热更快，出峰时间更早，但是总的产热量却相差不大。这是由于在线粒体进行正常代谢时，总的产热量取决于反应体系中的总含氧量，当氧气耗尽时，线粒体的氧化过程不能继续进行，因此总热量保持在一个稳定的数值范围之内。在本文的实验条件下，产热量通常为10 J左右。

图1 15 mmol·L-1琥珀酸钠作为底物时不同浓度线粒体的热量曲线Fig.1 Thermogenic curves of mitochondria with 15 mmol·L-1 of succinate as respiratory substrate.

3.2 不同底物对线粒体代谢的影响

呼吸链是线粒体中非常重要的功能组成部分，包含复合物 I (NADH脱氢酶和铁-硫蛋白组成)、复合物II (琥珀酸脱氢酶和硫铁蛋白组成)、复合物III (细胞色素c氧化还原酶复合体，含有铁硫蛋白)、复合物IV (细胞色素c氧化酶复合体，含有铁硫蛋白)和ATP合成酶(ATPase)。由I-III-IV组成的电子传递链为主呼吸链，由 II-III-IV组成的电子传递链为次呼吸链。呼吸链传递电子的过程中将质子由线粒体基质泵出到线粒体内膜外侧，而ATPase则利用质子回到基质的势能，合成ATP，输送给细胞，此过程中O2在复合物IV上被还原成 H2O。因此，呼吸链是线粒体能量代谢中最重要的部分21。图 2反映了相同条件下加入不同底物时，离体线粒体的产热曲线，此实验中所用的线粒体浓度为7.0 mg protein·mL-1。琥珀酸钠是呼吸链复合物II的直接底物，显示出了最大的产热功率和最大的新陈代谢速率，如表2b所示。丙酮酸钠也是线粒体中重要物质之一，是糖酵解的产物，被丙酮酸脱氢酶转化成为乙酰辅酶 A，后者是柠檬酸循环的起始物质22。丙酮酸钠作为底物时，最大产热功率、峰位置和热活性增长速率常数，均小于琥珀酸钠，但大于不加底物的情况。本实验说明，在直接底物琥珀酸钠的作用下，线粒体具有更大的产热功率和更快的热量响应，而不加底物时，产热速率最缓慢。实验结果符合线粒体的结构与功能原理。

表2 不同条件下线粒体能量代谢的热动力学参数Table 2 Thermokinetic parameters of mitochondrial metabolism in different conditions.

3.3 Ca2+和CsA对线粒体能量代谢的影响

在线粒体的研究中，CsA和 Ca2+是最常用到的工具药。CsA是经典的线粒体渗透转换孔(MPT)抑制剂，能够有效保护线粒体受多种物质诱导引起的MPT23,24。MPTP是非特异性的通道，由线粒体基质侧亲环素D (Cyp D)、线粒体内膜上的腺嘌呤核苷酸转运酶(ANT)和线粒体外膜上的VDAC组成25。MPT发生后，溶剂以及小分子进入线粒体基质，引起线粒体膜电位的丧失、基质肿胀以及凋亡因子释放，在线粒体途径诱导的细胞凋亡中占有重要地位。Ca2+是细胞的第二信使，对于细胞功能的调控起着不可或缺的作用。线粒体是细胞的钙库，调节 Ca2+在细胞中的浓度以维持细胞的正常功能。过量的 Ca2+能引起线粒体肿胀、膜电势坍塌，文献表明 Ca2+损伤线粒体的途径为诱导MPTP的开放26，而这种效应能被CsA所完全抑制27。本研究考察了低浓度和高浓度下Ca2+对离体线粒体能量代谢的影响。如图 3和表2c所示，低浓度Ca2+(0.1 mmol·L-1)对线粒体产热没有明显影响，而高浓度Ca2+(2.5 mmol·L-1)不仅使线粒体的产热大大提前，最大产热功率达到 2倍，同时总产热量也接近2倍，说明高浓度Ca2+明显地加快了线粒体的代谢。由于过量的 Ca2+对线粒体功能有损伤作用，因此，过早的产热代表着线粒体产热功能不再受到调控，而是爆发式地将O2耗尽然后衰亡。由图可知，通常线粒体的代谢分为几个阶段：活性停滞期、产热期和衰亡期。量热实验之前，线粒体储存于0 °C冰水浴中8-10 h，旨在使线粒体活性停滞，以便于加入到30 °C TAM III之后，能够观察到完整的热量曲线。进样后，通常离体线粒体活性的停滞期长达10 h，然后开始进行代谢并且产生热量。电子经呼吸链传递，O2被复合物IV还原，ATP合成酶生成ATP，这一系列的化学反应过程伴随着热量的产生。当Ca2+过量时，引起ROS水平的上升，ROS攻击蛋白、脂质和DNA，使之发生了不可逆转的氧化反应，此时产热曲线不同于对照组，热量除了在正常消耗O2的过程中产生外，还伴随着其他一系列非正常的氧化反应。正因如此，与其他实验结果所不同的是，在高浓度 Ca2+作用下，产热的总量并不只依赖于容器中氧气的总量，还发生了其他产热反应，导致总产热量加倍。CsA尽管能够抑制 Ca2+诱导的线粒体肿胀及膜去极化，然而在长时期的代谢中，CsA的加入却没有对 Ca2+的影响产生作用。本实验结果说明，线粒体的短期检测与长期代谢的结果并不完全一致，因此用微量热法测量线粒体的热量代谢是研究药物与线粒体相互作用的重要手段。

图2 不同底物存在时线粒体的热量曲线Fig.2 Thermogenic curves of mitochondria with different substrates.

图3 Ca2+和CsA存在时线粒体的热量曲线Fig.3 Thermogenic curves of mitochondria with Ca2+ and CsA.

3.4 不同缓冲液中线粒体的能量代谢

图 4为不同缓冲中线粒体的能量代谢曲线。除了常用作生物介质的磷酸缓冲液外，另外几种溶液分别为提取及纯化后线粒体的储存液 Media C、用于检测线粒体肿胀和膜电位等性质的缓冲液(Mitochondrial analysis buffer，MAB)、用于检测线粒体耗氧速率的缓冲液(Mitochondrial respiratory buffer，MRB)、用于检测内膜对 H+和K+渗透能力的缓冲液(Buffer H，Buffer K)28。6种不同的缓冲液中，线粒体的能量代谢显示出了最明显的区别。以不含营养物质的 PBS为界限，Buffer K由于与线粒体不等渗，线粒体逐渐发生肿胀，跨膜电势逐渐下降，因此抑制了线粒体的代谢。Media C中含有蔗糖和甘露醇，MAB和MRB中含有蔗糖，可能是这三种缓冲液中，线粒体的热活性增长速率常数比PBS中大且产热更快的主要原因。由于 MAB中含有呼吸底物琥珀酸钠，因而产热功率最大。

图4 不同缓冲液中线粒体的热量曲线Fig.4 Thermogenic curves of mitochondria with different buffers.

Buffer H则完全抑制了线粒体的产热。Buffer H与Buffer K的差异在于，将KNO3换成了KAc和缬氨霉素。线粒体内膜具有高度选择性，不允许大部分分子和离子通过，包括质子，因此探究线粒体功能变化时，通常会考察内膜对 H+和 K+的透过能力。检测内膜对K+渗透能力时，缓冲液中加入了 135 mmol·L-1的 KNO3，由于 NO3-可以自由穿透内膜，因此其对电位差没有影响，而K+不能自由进出内膜，在电位差的驱动下，K+会由内膜上的K+通道转运入基质，引起电位差的下降，线粒体发生肿胀，540 nm处的吸光度下降29。以此通过线粒体吸光度的下降程度来判断内膜对K+通透性的变化。而检测内膜对H+的渗透能力时，缓冲液中加入的是 1 μg·mL-1缬氨霉素和 135 mmol·L-1KAc。K+对电位差的影响在脂溶性 K+载体缬氨霉素的运载下被消除掉。Ac-不能透过内膜，而HAc能透过内膜30。内膜外侧的H+与Ac－结合，以HAc的方式进入基质并解离，导致线粒体内膜两侧质子浓差消失，从而影响线粒体功能。为了探究Buffer H使线粒体能量代谢停止的原因，我们进一步探究了 Ac-和缬氨霉素对线粒体能量代谢的影响。结果发现，缬氨霉素的加入并不会使线粒体产热停止，而有KAc、KAc+缬氨霉素、NaAc、NaAc+缬氨霉素存在时，线粒体均不产热。因此，使线粒体不产生热量的根源在于 Ac-的引入。结合理论与实验结果推测：有Ac-存在的情况下，线粒体无法保持内膜外侧的质子浓度，而ATP的合成依赖于质子在ATP合成酶位点泵入基质而产生能量31，因此线粒体的热量代谢受到抑制。同样的现象未发生在Buffer K的情况下，是由于尽管K+的浓差消失，但是质子梯度仍可维持。然而更深层次的机理，还有待于进一步探讨。

以上实验为线粒体在不同条件下的能量代谢提供了理论基础。由于线粒体存在多种不同的状态：活性良好、活性较差、偶联状态、解偶联状态、富能量状态和饥饿状态等等，而不同的药物对线粒体的影响不同，研究离体线粒体时只研究某一种状态下的活性是远远不够的。此外，同一种条件对不同的药物可能产生限制，因此考察多种缓冲液以及多种条件下的线粒体性质具有重要意义。

3.5 呼吸链抑制剂对线粒体能量代谢的影响

呼吸链上的酶具有高效催化活性，是线粒体进行正常生理功能的必要条件。当呼吸链复合物受到抑制时，生物体的活性也会受到影响。鱼藤酮是一种强杀虫剂，通过抑制线粒体呼吸链复合物 I来抑制呼吸作用，是线粒体研究中应用较多的工具药32。丙二酸钠是复合物II的抑制剂，与琥珀酸钠为竞争性抑制关系，因此对呼吸链具有抑制作用33,34。复合物IV是呼吸链中最重要的酶，其活性直接关系到生物体是否能存活。剧毒的氰化钾可使人在数分钟内死亡，因为 CN-与复合物IV紧密结合，使其不能进行电子传递。另外，对人生命具有巨大威胁的CO、叠氮酸都是复合物IV的抑制剂35,36。本文选用了几种呼吸链抑制剂研究离体线粒体的能量代谢。

图5 呼吸链抑制剂(鱼藤酮、丙二酸钠和NaN3)存在时线粒体的热量曲线Fig.5 Thermogenic curves of mitochondria with several respiration inhibitors (rotenone, malonate and NaN3).

由图5看出，40 μmol·L-1鱼藤酮对线粒体的能量代谢抑制作用并不明显，但是代谢速率常数明显下降，如表2e所示，空白线粒体的热量增长速率常数为0.436 h-1，而鱼藤酮加入后，热量增长速率常数下降至0.210 h-1。由于鱼藤酮是复合物I的抑制剂，通常用于抑制复合物I的浓度为2 μmol·L-1，而本实验中线粒体浓度约高其他实验中的15倍，且为了显示出其抑制效果，所选用的浓度为40 μmol·L-1。线粒体含有两条呼吸链，加入鱼藤酮后，由复合物 I开始的主呼吸链虽然受到抑制，但是琥珀酸钠作为底物启动的是以复合物II开始的次呼吸链，因此总体上鱼藤酮对线粒体代谢的抑制不甚明显。8 mmol·L-1丙二酸钠是复合物II的竞争性抑制剂，由于本实验中加入了15 mmol·L-1琥珀酸钠作为底物，因此选择了近似浓度的丙二酸钠。丙二酸钠加入后在前期刺激了线粒体的能量代谢，这是由于其与琥珀酸钠都能作为复合物II的底物，然而由于其占据了琥珀酸钠的位点，从而在第二段产热期明显地抑制了产热增长速率。0.03 mmol·L-1NaN3对线粒体的代谢有少许的抑制作用，而0.3和3 mmol·L-1NaN3则彻底抑制了线粒体的代谢，说明在一定浓度下NaN3能够使线粒体完全失活，这也验证了NaN3对呼吸链的毒性。这三种呼吸链抑制剂都体现了对线粒体能量代谢的抑制作用，与已报道的药物性质一致，说明微量热实验能够反映出离体线粒体的功能和活性的变化，为今后探究各种生物材料对线粒体的可能毒理提供了实验方法和理论依据。

4 结论

本研究以离体大鼠肝脏线粒体为模型，考察了不同条件下线粒体的能量代谢。实验发现，在不同的条件下，离体线粒体的能量代谢曲线表现出差异性，通过计算所获得的新陈代谢速率常数也呈现出与理论相符的规律。增加线粒体浓度、加入线粒体呼吸底物、加入细胞第二信使Ca2+，都能促进线粒体的代谢。而几种呼吸链抑制剂则都表示出对线粒体能量代谢的抑制作用。同时，由于不同缓冲液中组分不同，线粒体的能量代谢也体现出了差异，这为探索药物对不同条件下线粒体的影响提供了实验基础。以上实验结果显示了已报道的药物功效与线粒体体外实验的一致性，证明了微量热实验的可行性和优良性，补充了体外检测线粒体手段的不足，为线粒体的研究提供了有效的方法。

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