窖泥及窖泥功能菌液微生物群落的研究进展与发展趋势

杜礼泉

（四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川 绵阳 621000）

微生物群落是一定区域内或者一定生境中，各种微生物种群之间相互松散结合而成的一种结构单位[1]。一定的微生物种群组成微生物群落，对周围的生态环境有一定的需求和反应是微生物群落的特性，不同微生物种群在群落中处于不同的地位并具有不同的作用。窖泥中的微生物是在窖池这一特殊环境中形成的微生物群落。

在浓香型大曲酒生产中，窖泥质量的好坏决定着所产酒质量的优劣，这主要是由于窖池中浓香、窖香和复杂香气物质的生成量由窖泥中生香功能菌生成这些风味物质的能力决定[2]。一般来说，窖泥的窖龄越长，所富集的功能微生物越多，其酿出来的酒越香醇，而对于老窖泥中功能微生物的研究一直都是浓香型白酒的一个重要课题。本文就窖泥微生物群落的研究、窖泥功能菌液微生物群落的研究、窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究的发展趋势3个方面进行综述，以期为窖泥微生物有效的人工动态调控提供理论依据。

1 窖泥微生物群落的研究

利用窖泥发酵生产浓香型白酒至少有数百年之久，但窖泥中微生物的研究长期以来都处于空白状态，直到20世纪60年代，我国才开始对窖泥中的微生物展开研究，通过50多年的研究，窖泥微生物群落研究取得了大批科研成果。目前，窖泥微生物的研究技术主要采用了纯培养技术与免培养技术，现将这两类技术在窖泥微生物群落研究中取得的主要成果作一概述。

1.1 微生物纯培养技术在窖泥微生物群落研究中取得的主要成果

在微生物群落研究中，纯培养技术（如平板划线分离法、稀释倒平板法、单细胞分离法、选择性培养分离法等）已发展为研究微生物不可或缺的手段。在19世纪科赫（Koch）首次建立微生物的纯培养技术后，科研人员已经采用纯培养技术培养了几千种细菌、病毒以及10万种左右的真菌。

在窖泥微生物群落的研究中，采用纯培养技术，从窖泥中分离和鉴定出己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、甲烷氧化菌、硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌、丙酸菌等一系列微生物。但是，到目前为止，其中只有少量微生物在浓香型大曲酒中的作用的研究较清楚，在生产中采用人工培养的方式进行应用的微生物则更少[2]。

窖泥中己酸菌的研究：始于1964年轻工部茅台试点组对浓香型主体香味物质己酸乙酯的研究，并成功地从窖泥中筛选出产己酸为主的己酸菌[3]。

窖泥中丁酸菌的研究：在己酸菌的研究基础上陆续展开窖泥中丁酸菌的研究，内蒙轻工所[4]研究发现，丁酸菌在窖泥中生成的丁酸是合成己酸的前体物质。另外，丁酸菌在新窖泥中对正丁醇的大量生成还起到重要的作用[5]。

窖泥中甲烷菌的研究：吴衍庸等[6]在1984年研究窖泥微生物群落时，分离出了甲烷细菌菌株，并通过研究窖泥中产甲烷菌的数量发现，甲烷菌数量与窖泥质量的好坏关系密切，窖泥中甲烷菌数量的多少可判断窖泥是否老熟。甲烷菌可实现“种间氢转移”关系，使各种产H2型发酵得以在窖内有效进行，且更有利于己酸发酵，是己酸菌与甲烷菌共栖的作用[6]。

窖泥中放线菌的研究较少：栾兴社[7]从窖泥中选出兼性自养型链霉菌，并对其生理生化能力进行了较深入的研究。李良等[8]从浓香型夏季窑泥中分离得到1株放线菌。

窖泥中酵母菌的研究方面：倪斌等[9]对浓香型白酒人工窖泥中的微生物变化进行了研究，酵母数量在酿造过程中减少。

窖泥中丙酸菌的研究：主要是集中在不同位置窖泥中丙酸菌的含量以及丙酸菌转化乳酸的途径[4]。

窖泥中不同微生物分布的研究方面：吴衍庸等[10]研究了不同类型微生物在不同窖龄窖池中的分布概况，并发现了相关规律。

1.2 微生物免培养技术在窖泥微生物群落研究中取得的主要成果

在自然环境中仅有0.1%～10%的可培养的微生物，因此，采用可培养技术研究微生物群落的多样性特点十分困难[11]。不能采用可培养方法培养的微生物叫做未培养的微生物（uncultured microorganisms）。目前，对未培养微生物的研究主要采用免培养技术，如聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlength polymorphism，RFLP）技术、聚合酶链式反应-单链构象多态（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）技术、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术等，且该技术在窖泥微生物群落的研究中已取得了一系列成果。

黄永光等[12]较早从窖泥中提取微生物的总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）并进行研究。

采用PCR-DGGE技术进行窖泥微生物多样性的研究方面：王海英等[13]采用DGGE技术对水井坊酒厂窖龄分别为50及150年相同窖池不同部位窖底泥（三点取样法）进行细菌、古菌和真菌微生物群落特征分析；黄治国等[14]采用PCR-DGGE技术探索不同窖龄窖泥细菌类群及群落演变规律。

采用PCR-SSCP技术进行窖泥微生物的研究方面：罗惠波等[15]利用该技术研究认为，相同位置窖泥微生物的多样性指数与窖龄相关；同样，黄治国等[16]研究发现，窖壁上层和窖底窖泥的多样性指数随着窖龄增加而增加，窖壁下层窖泥的多样性指数则先降低后再增加。

在以微生物细胞膜的特征组分磷酸脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）为指标研究窖泥方面：郑佳等[17]研究不同窖龄窖泥的微生物群落结构特征时发现，300年窖池的窖泥中直链饱和脂肪酸含量最高，真菌PLFA含量在5年窖泥中均高于其他窖龄相应样品，而表征革兰氏阳性（G+）菌、革兰氏阴性（G-）菌和厌氧菌的PLFA含量高于其他窖龄相应样品的为100年的窖泥。

采用免培养技术研究窖泥微生物群落的其它主要成果：向文良[18]通过对窖泥中原核微生物群落的研究发现了窖泥中的主要优势菌群，其中，甲烷微菌目和甲烷八叠球菌目为古细菌主要优势菌群；李家民等[19]研究发现，不同窖龄窖泥的微生物群落结构差别不明显；何翠容等[20-21]采用了FISH技术研究窖泥微生物群落时发现，300年的窖龄的窖泥中细菌数量最多，达到11.19×109cells/g，100年窖龄的窖泥中古菌数量最高，达到12.61×109cells/g，古菌数量、细菌数量最低的为试验窖池的窖泥，其含量分别为0.82×109cells/g、0.78×109cells/g；邓依等[22]采用指纹图谱分析技术研究发现，在老窖的窖底泥和新窖的窖底泥中，原核微生物多样性存在着显著差异；罗青春等[23]采用了荧光定量聚合酶链式反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）法，对不同窖龄窖泥中甲烷菌进行研究时发现，产甲烷菌属的Copies数随着窖龄的增加呈递增趋势。

2 窖泥功能菌液微生物群落的研究

窖泥作为窖池中微生物的主要载体，往往含有大量对白酒酿造起关键作用的功能微生物。窖泥中微生物的种类和数量一般与窖泥的窖龄相关，窖泥的窖龄越长，窖泥中微生物的种类就越多，数量也越多[24]。

传统浓香型大曲酒的生产，窖泥中的微生物由自然接种、自然驯化而成，自窖泥中的功能菌（甲烷菌、丙酸菌、己酸菌等）的发现进行了很多人工培养窖泥功能菌的研究，其中，窖泥功能菌液的有效研发并用于生产是一项重要的内容[25]。吴衍庸等[6]首次对甲烷菌的筛选、培养以及应用进行研究发现，甲烷菌、己酸菌混合培养和应用对提高酒体己酸乙酯含量效果很好。钟雨等[26]在丙酸菌的研究与应用方面开展了较为有效果的试验，研究表明，丙酸菌在浓香型大曲酒生产中具有“增己降乳”的作用。

1964年轻工部茅台试点组从窖泥中筛选出了己酸菌，1975年内蒙轻工所在此基础上，采用纯培养方法也从老窖泥中筛选出了己酸菌，同时，研究了己酸菌的培养方法[4]。在己酸菌的生理代谢研究方面。沈怡方[27]经过一系列试验发现，如果培养基中乙酸钠匮乏时，则易使丁酸的含量增加，如果在培养基中增加淀粉类碳源时，则使己酸的含量降低，而使丁酸的含量增加。己酸菌培养的改进方面：杜礼泉等[28]改进了不锈钢罐培养和培养基（去掉了钙类物质）[28]；娄虹等[29]采用了固定化方法培养己酸菌；王瑞明等[30]采用絮凝技术提高了培养液中己酸菌的数量。杜礼泉等[31]解决了己酸菌培养中变黑、发臭的问题。

在窖泥复合功能菌培养方面：姚万春等[32]将从优质老窖泥中分离到的优良窖泥功能菌株进行扩大培养，生产浓香型白酒窖泥功能菌液（简称：液体窖泥），用于培养优质人工老窖泥，具有很强的实用性和较大的技术参考价值。姚万春等[33]采用浓香型白酒窖泥功能菌液作为主要菌种培养优质人工老窖泥；万联[24]将己酸菌、丁酸菌及酵母复配得到的复合菌液用于养护液的制备，并将其运用于新窖池的强化；杜礼泉等[4，28，33-35]研制了己酸菌、液体窖泥混合培养液、窖泥复合功能菌液（调节窖泥pH、生成己酸等香味物质的功能）和特殊生香功能菌液（生成酒体所需的复合香味物质）。

3 窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究的发展趋势

窖泥质量对白酒质量有着极其重要的影响。传统方法生产浓香型大曲酒，主要依靠窖泥从环境中自然接种、自然驯化，然后缓慢老熟。要生产优级酒，需要数十年之久。在优质白酒需求量突飞猛进的今天，采用窖泥自然老熟的方法生产浓香型白酒，远远不能适应社会的发展，因此，人工培养窖泥功能菌并用于加快窖泥老熟，是现代化企业所急需的。然而，要人为加快窖泥老熟或对窖泥在使用过程中进行有效调控，其实质就是对窖泥微生物的有效调控。对于白酒企业来说，实现对窖泥微生物有效的人工动态调控，使窖泥较快地向优质窖泥转变、维护窖泥质量和提高窖泥质量，是研究窖泥和窖泥功能菌液微生物群落的重点。结合白酒行业对窖泥及窖泥功能菌液微生物群落的最终目的以及窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究存在问题的分析，对今后窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究的发展趋势进行预测。

3.1 理论研究与应用研究相结合

通过理论研究与应用研究相结合对窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究。

（1）针对不同质量的窖泥进行研究，对优质窖泥中起主要作用的微生物进行深入研究（如功能菌的鉴定、生理生化功能以及它们的数量和比例）[36-37]。

（2）起正向作用微生物（如生成有利于酒体口感或对有益人体物质的微生物）的调控：可培养的窖泥功能菌通过培养窖泥功能菌液的方式加入窖泥中，尚不能纯培养的窖泥功能菌则通过改进窖泥培养工艺或生产工艺等方式进行调控。

（3）起反向作用微生物（如生成不利于酒体口感或有害人体物质的微生物）的调控：通过改进窖泥培养工艺或生产工艺等方式进行调控。

3.2 纯培养技术与免培养技术相结合

首先，采用免培养技术对窖泥微生物的种类进行鉴定以及数量（比例）的检测，再采用可培养技术研究不同种类的窖泥微生物在窖泥中的生理生化功能，从而确定其在白酒酿造中的作用、有无人工培养应用的价值以及人工调控技术。目前，黄丹等[38]已经在窖泥微生物群落的纯培养技术与免培养技术相结合方面作了初步探索。

3.3 纯培养技术与免培养技术的技术进步

提高微生物在平板上的培养能力。窦敏娜[39]采用原位培养技术、改进培养基等方法，最终获得了数种在普通琼脂平板上无法培养的菌种。如能通过研究提高微生物在平板上的培养能力，将尽可能多的微生物转变成可被纯培养的微生物，从而确定这些微生物在白酒酿造中的作用，并以窖泥功能菌液的方式对窖泥进行微生物种群的强化。

免培养技术的发展极为迅速，如聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）、磷脂脂肪酸（PLFA）法、限制性片段长度多态性（RFLP）技术、荧光原位杂交（FISH）技术、随机扩增多态性DNA标记（random ly amplified poly morphic DNA，RAPD）技术、扩增核糖体基因限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）法、聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术、荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术、宏基因组学技术等，其中一些技术在窖泥微生物的研究中已有初步探索。

当然，对于窖泥中不可培养的微生物在研究手段上还有待突破，如PCR-DGGE等通过提取、鉴定窖泥微生物DNA的技术，无法测定窖泥中微生物数量；荧光原位杂交（FISH）技术在研究窖泥微生物时，可测定微生物数量，但其准确度有待提高，并且，由于核酸探针种类的限制，在微生物种类鉴定上也存在很大难度。

3.4 其他相关技术

BIOLOG微平板技术在酿酒微生物的研究方面有所探索[40]，在窖泥微生物研究方面值得借鉴。

4 结束语

窖泥及窖泥功能菌液微生物群落的研究如能在已有成果基础上，通过纯培养技术、免培养技术以及BIOLOG微平板技术、微生物生物量的研究等方法的应用，通过理论研究与应用研究相结合，有望早日实现对窖泥微生物有效的人工动态调控，达到窖泥较快地向优质窖泥转变、维护和提高窖泥质量的目的，从而促进浓香型白酒的技术提升和进一步发展。