基于斑马鱼幼鱼模型的甘遂毒性评价*

梅 雪，罗 隽，夏 青，冯娅茹，索亚然，李二文，王昭懿，马志强，林瑞超

甘遂为大戟科植物甘遂（Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.RWang）的干燥块根，可泻水逐饮，消肿散结。常用于肝硬化腹水、胸腔积液、水肿等病症[1]，现代临床也用于治疗晚期食道癌、乳腺癌等肿瘤及慢性支气管炎等疾病[2]。药理研究表明，甘遂具有抗肿瘤、抗病毒、治疗胰腺炎、免疫抑制等多种药理活性[3-4]，但其毒性作用却严重制约着它的临床应用。

斑马鱼具有繁殖速度快、子代数量多、胚胎透明等生物学特性，目前已在药理和毒理研究方面得到了广泛的应用[5]。利用斑马鱼模型可以高效、直观地评价药物的心血管、肝脏、肾脏和神经等靶器官毒性[6]，研究数据表明该模型对药物的心血管、肝脏、胃肠道和神经毒性的评价结果与人体试验结果的一致性平均达到了80%以上[7-9]。斑马鱼模型系统既具有细胞等体外实验用药量少、费用低、周期短、高通量等特点，又具备整体动物实验可观察多个器官[10]、涵盖体内代谢与内环境变化对药物的毒性影响等优势。斑马鱼幼鱼模型克服了细胞和化学筛选模型的局限性，从整体水平直观地评估药物的毒性作用，很好填补了细胞模型和啮齿动物模型过渡的空白[11]。

目前关于甘遂的毒性评价比较混乱，有关实验证明其确实存在较强的毒性作用，但均存在对其毒性特征描述不确切，靶器官研究不充分，毒性可逆性研究缺失等问题[12-15]。故本实验拟用斑马鱼幼鱼为模型，评价甘遂不同极性溶剂提取物毒性差异，完善对甘遂的毒性评价，同时为该模型在中药毒性评价中的应用提供参考。

1 实验材料

1.1 药物和试剂 去离子水、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠等为分析纯，购自北京化工厂。氯化钙、三卡因、甲基纤维素等购自Sigma公司。干酵母片购自北京同仁堂。

1.2 动植物 甘遂购自河北安国药材市场，经北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定为大戟科植物甘遂的干燥块茎。

野生型AB系斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心。丰年虾，购于天津丰年水产养殖有限公司。草履虫，实验室养殖。

1.3 仪器 斑马鱼循环水养殖系统（北京爱生科技公司），恒温培养箱LRH-250Z（广州瑞明仪器有限公司），蔡司体式荧光显微镜（Zeiss,Axio Zoom V16），数显恒温水浴锅（天津泰斯特有限公司），ZDHW电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），OSB-2100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 甘遂提取物及幼鱼暴露液的制备 称取甘遂生品50 g，粉碎，过40目筛，置于索氏提取器中，依次按顺序以10倍质量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇为溶剂，进行连续提取。每个溶剂提取6 h，更换提取溶剂时，挥干药材粉末中所含上一溶剂。所得提取液经浓缩干燥后，存于干燥器中备用。

以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，制备500 mg/mL的提取物母液。实验时用幼鱼养殖水将母液稀释至所需浓度。

2.2 斑马鱼幼鱼的繁育 斑马鱼成鱼养殖于斑马鱼循环水养殖系统中，控制水温（28.0±0.5）℃，光照周期为明暗14∶10 h交替，系统水pH为6.8～7.2，电导率为400～500μs，每日喂食新孵化的丰年虾3次。产卵前1 d晚上按雌雄1∶2比例配鱼，第2天待产卵完成后，收集受精卵，挑除死卵及杂质，用幼鱼养殖水清洗3次，置于28.5℃光照培养箱中培养，光照周期为明暗 14∶10 h。

2.3 甘遂不同提取物毒性比较 显微镜下挑选发育正常的受精后3 d（dpf）幼鱼，置于12孔板中，每孔20条幼鱼，给予暴露液3 mL，连续给药72 h，每24 h 更换暴露液。预实验以 0.01、0.1、1、10、100、200、500μg/mL提取物为给药浓度，根据实验结果，调整给药浓度，确定甘遂暴露给药72 h（hpe）的最大不致死浓度和最小全致死浓度，并在此区间选择设定成等差数列的6～8个药物浓度建立致死曲线。实验重复3次。实验以给药后72 hpe斑马鱼幼鱼死亡率与实验浓度梯度呈良好线性关系（r2≥85%），且半数致死浓度（LC50）的RSD≤0.1为有效值。

根据致死曲线计算各提取物半数致死浓度，根据LC50及所含原生药量比较不同溶剂连续提取物的毒性差异，并根据致死曲线计算最毒提取物的最小致死浓度（LC1）、和 10%致死浓度（LC10）。

2.4 毒性指标及可逆性观察 以幼鱼养殖水为空白对照组，以含助溶剂0.1%DMSO的幼鱼养殖水为溶剂对照组，选用 1/10 LC1、1/3 LC1、LC1、LC104 个浓度作为毒性指标及可逆性观察的给药浓度。实验设立6个重复组，其中3组给药72 h后，观察暴露液对各个脏器系统毒性指标产生的影响，另外3组给药72 h后，吸除暴露液并用养殖水清洗3次，置于12孔板中以养殖水培养恢复48 h，观察毒性可逆性。各给药组及恢复组于体式显微镜下观察并拍照，记录各毒性观察指标的变化。

2.5 苏木精-伊红（HE）染色观察 给药和恢复结束后，存活幼鱼以磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次，置于离心管中，加4%多聚甲醛于4℃固定24 h，常规切4μm切片。染色步骤如下：1）切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）6 min→二甲苯（Ⅱ）6 min→100%乙醇6 min→95%的乙醇6 min→80%乙醇6 min→75%乙醇6 min→蒸馏水洗6 min。2）苏木素染色5 min，自来水冲洗。3）盐酸乙醇分化10 s。4）自来水浸泡15 min。5）置伊红液2 min。6）常规脱水，透明，封片：95%乙醇（I）1 min→95%乙醇（Ⅱ）1 min→100%乙醇（I）1 min→100%乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3∶1）1 min→二甲苯（I）1 min→二甲苯（Ⅱ）1 min→中性树脂封固。

2.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 甘遂提取率 按照上述实验方法制备得到甘遂不同溶剂提取物，提取率依次分别为石油醚6.32%、二氯甲烷1.92%、乙酸乙酯1.85%、95%乙醇3.31%。

3.2 甘遂不同提取物毒性差异 按上述2.2及2.3方法，根据预实验结果，确定了甘遂不同提取部位的实验浓度，重复给药3次，统计斑马鱼幼鱼死亡数，根据斑马鱼幼鱼死亡率建立致死曲线，见图1，并计算LC50。实验结果显示甘遂不同提取部位毒性依次为石油醚＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞乙醇提取物；LC50依次为（0.107±0.006）、（0.416±0.005）、（4.516±0.035）、（24.281±1.370）μg/mL。故在后续的实验中，将主要以石油醚提取物为研究对象，评价甘遂毒性。

3.3 甘遂毒性及可逆性观察

3.3.1 心脏毒性 如图2所示，给药组和恢复组斑马鱼幼鱼心脏未出现心包水肿、出血瘀血等异常现象，显微镜下观察心脏形态正常，心区血流正常、无心律不齐。根据统计，给药组和恢复组均与对照组心率差异无统计学意义，说明甘遂无心脏毒性。见表1。

3.3.2 神经毒性 如图2所示，斑马鱼脑部未出现水肿、畸形等异常形态，脑区颜色正常，说明脑部未发生变性，说明甘遂无脑毒性。

3.3.3 胃肠道刺激性 如图2所示，结合镜下观察，斑马鱼胃肠道区域颜色略有变化，变得灰暗，显示可能出现轻微肠变性，镜下肠褶皱无明显变化。0.050 和0.070μg/mL组肠腔略有变小，可能为毒性变化所致。肠道尼罗红排泄实验显示排泄率呈剂量依赖性增高（荧光强度越低说明排泄率越高），说明甘遂具有胃肠道刺激性。见表2。

图1 甘遂不同溶剂提取物致死曲线Fig.1 Lethal curve of Radix Kansuiextracted with different solvent

表1 甘遂给药组及恢复组相对心率（x±s）Tab.1 Relative heart rate in Radix Kansuitreatment and recovery group（x±s）

3.3.4 肝脏毒性 如图3所示，正常的斑马鱼肝脏界限清晰，纹理清晰均匀，给药后肝脏界限变模糊且肝区颜色变为灰暗色，纹理混乱。统计数据见表3和表4，给药组肝脏面积在0.070μg/mL给药组中显著增大，停药后恢复48 h，相对肝面积进一步增大，说明甘遂高浓度使幼鱼肝脏肿大，且停药后肝肿大未出现可逆性；给药组肝脏面积在0.050μg/mL给药组中未显著增大，但停药后恢复48 h，相对肝面积进一步增大，说明此浓度会造成持续性肝损伤；给药后肝区光强度在 0.005、0.050、0.070 μg/mL 给药组中显著降低，停药后恢复48 h光强度出现可逆性。综上所述，说明甘遂具有肝毒性，可使肝肿大和肝变性，肝肿大不可逆，而肝变性具有可逆性。

3.3.5 肾毒性 如图4所示，斑马鱼躯体形态正常，未出现肾性水肿等异常现象，说明甘遂无肾脏毒性。3.3.6 其他毒性特征观察结果 如图4所示，与对照组相比，给药后斑马鱼眼、下颌、身体着色、鱼鳔、肌肉和鱼鳍等均无异常，全身无出血、淤血等现象。

图2 甘遂心脏区域、脑区和肠区形态变化（×80）Fig.2 Morphological changesof heart,nervoussystem and gastrointestinal tract in Radix Kansui（×80）

表2 甘遂给药组肠染色相对荧光强度（x±s）Tab.2 Relative fluorescenceintensity of intestinal staining in Radix Kansuitreatment group（x±s）

图3 甘遂肝脏形态变化（×80）Fig.3 Morphological changes of liver in Radix Kansui（×80）

表3 甘遂给药组及恢复组肝区相对肝面积（x±s）Tab.3 Relative liver area of Radix Kansuitreatment and recovery group（x±s）

表4 甘遂给药组及恢复组肝区相对光强度（x±s）Tab.4 Relative liver light intensity of Radix Kansui treatment and recovery group（x±s）

3.3.7 HE染色结果 如图5所示，甘遂给药后对肝脏组织损害较大。空白组和溶剂对照组中，肝脏、肠道等区域细胞完整，细胞核明显，细胞质均匀。在甘遂LC10浓度给药组中，肝脏细胞排列松散，肝实质细胞减少，空泡现象增多，细胞界限不明晰。在恢复组中，虽略有所好转，但肝细胞毒性损害仍比较明显。

图4 甘遂肾性水肿观察结果及其他毒性指标形态变化（×30）Fig.4 Nephrogenic edema and morphological changesof other toxic index in Radix Kansui（×30）

图5 甘遂对斑马鱼幼鱼的毒性影响（HE染色，×400）Fig.5 Toxic effectsof Radix Kansuion zebrafish larvae（HE stain,×400）

4 小结

本实验首次以斑马鱼幼鱼为模型，单次给药，同时评价了甘遂毒性对机体心脏、肝脏、肾脏、神经系统、胃肠道等脏器系统的毒性作用及可逆性，并证实了甘遂可对肝脏和胃肠道造成实质性损伤，为斑马鱼模型在中药毒性评价中的应用提供了参考。

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