心脑舒通胶囊对血管性痴呆大鼠的神经保护作用*

Batnairamdal Chuluun，王金鑫，李芮琳，卢国彦，郭 虹，柴丽娟，张 玥，王少峡，胡利民

血管性痴呆（VD）是与脑血管疾病有关的老年期痴呆的一种主要类型，多与神经损伤、脑血管疾病的危险因素（高血压、糖尿病等）有关，临床表现为认知功能障碍，记忆力下降等[1]。随着中国老龄化社会的到来，近年VD的发病率明显上升，所以寻找有效预防和治疗VD的药物迫在眉睫。心脑舒通胶囊的有效成分为蒺藜科植物的干燥全草提取物,其主要成分为以呋甾醇与螺甾醇为主要成分的蒺藜总皂苷，具有活血化瘀，舒利血脉的作用[2-3]。临床多应用于防治胸痹心痛、中风恢复期的半身不遂、语言障碍和动脉硬化等心脑血管缺血性疾病，并取得确切的疗效[4-5]。本研究采用双侧颈总动脉永久性结扎的方法制作VD大鼠模型，通过考察痴呆大鼠学习记忆能力、大脑海马区神经细胞的状态、星形胶质细胞及小胶质细胞的表达来探究心脑舒通胶囊对VD大鼠的神经保护作用及可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雄性SPF级Wistar大鼠80只，体质量（300±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（北京）2012-0001，动物饲养于天津市实验动物中心，分笼饲养，自由饮食、饮水，饲养温度为22～25℃，相对湿度40%～60%，每周更换垫料2次。

1.2 药品及试剂 心脑舒通样品（其中呋甾皂苷含量约占43.18%，由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供），临用前用生理盐水溶解。星形胶质细胞特异性蛋白GFAP的抗体（Sc-6171）、Donkey anti-goat Ig G（Sc-2042）购自 Santacruz；小胶质细胞特异性蛋白Iba-1的抗体（Ab5076）购自Abcam。尼氏染色试剂盒、防脱载玻片、中性树胶封片液购自碧云天公司。磷酸盐缓冲液（PBS）；多聚甲醛；二甲苯；无水乙醇；95%乙醇等化学试剂均为市售分析纯。

1.3 实验仪器 水迷宫系统（北京硕林源科技有限公司，Topscan lite）；全自动封闭脱水机（LEICA，ASP300S）；病理捞片机（LEICA，HI1210）；烤片机（LEICA，HI1220）；生物组织包埋机（BMJ-1，天津航空机电公司）；切片机（LEICA，RM2135）；光学显微镜（OLYMPUS，CHA30）；显微数码拍摄图像分析系统（Nikon，NIS-Elemenis）等。

2 实验方法

2.1 动物模型复制方法 参照文献[6]，本实验采用双侧颈总动脉永久性结扎的方法复制VD大鼠模型，术前12h禁食不禁水，异氟烷气体麻醉。将Wistar大鼠仰卧固定四肢，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉，用4号线结扎，缝合皮肤，一周后重新麻醉，分离右侧颈总动脉并用4号线进行结扎，缝合皮肤。对照组只分离颈总动脉，穿线但不结扎。

2.2 实验分组及给药 将造模成功的54只大鼠按照随机数字表法随机分为3组：心脑舒通56 mg/kg组（XNST-56）、心脑舒通 14 mg/kg组（XNST-14）、模型组各18只，对照组10只。心脑舒通组成模后给予心脑舒通混悬液（10 mL/kg体质量）灌胃；模型组和对照组给予等量的生理盐水灌胃，每天灌胃给药1次，持续给药60 d。

2.3 检测方法

2.3.1 Morris水迷宫检测 水迷宫实验是利用水迷宫系统和小动物运动行为分析系统研究大鼠的海马等脑区受到损害后的学习、记忆和空间定向以及认知能力的实验。分为环境熟悉、定位巡航和空间探索3个阶段。第1阶段主要使大鼠熟悉实验环境及实验人员；定位航行阶段，主要记录大鼠的逃避潜伏期的变化；空间探索阶段，主要记录大鼠穿过平台的次数和游泳速度。

2.3.2 海马CA1区的尼氏染色 大鼠光镜下观察海马CA1区神经细胞形态学改变，在40×10倍的光镜下随机选择5个视野，统计神经元的个数，以对照组作为100%，统计其他各组的百分比。

2.3.3 SABC法染色GFAP和Iba-1 星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba-1）染色标本为心脏灌流固定后的脑组织，进行切片。应用SABC免疫组化法和DAB显色法分别对组织中GFAP和Iba-1进行染色，光镜下观察星形胶质细胞的形态及数量变化情况。

2.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学处理。所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示，数据处理采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 心脑舒通胶囊对VD大鼠体质量的影响 造模成功后，给药过程中，每周称量一次大鼠体质量统计。见图1。从图1中可以看出，与对照组比较，手术组在初始前3周时，体质量显著下降（P＜0.01），给予心脑舒通胶囊治疗3周后，治疗组体质量增加，恢复到接近对照组的水平。

3.2 心脑舒通胶囊对VD大鼠学习和记忆的改善作用 水迷宫实验结果表明，心脑舒通胶囊对VD大鼠学习和记忆的改善作用，如图2所示。与对照组比较，模型组的逃避潜伏期明显增加（P＜0.01），与模型组比较，心脑舒通14 mg/kg及56 mg/kg组逃避潜伏期明显降低（P＜0.01）。空间探索实验表明，与对照组相比较，模型组通过平台的次数明显减少（P＜0.01），各治疗组通过平台次数有所增加，但无统计学差异。通过对各组大鼠空间探索阶段游泳速度的统计，各组大鼠体力没有统计学差异（P＞0.05）。

图1 心脑舒通胶囊对VD大鼠体质量的影响Fig.1 Effectsof XNST on VD ratsof body weight

图2 心脑舒通胶囊对VD大鼠学习和记忆的改善作用Fig.2 Effectsof XNST on VD ratsoflearning and memory ability

3.3 心脑舒通胶囊对VD大鼠脑组织病理损害的影响 尼氏染色结果表明，对照组脑组织切片中可见海马CA1区神经元细胞染色较深，尼氏体颗粒较大且多见，细胞排列整齐，核仁清晰可见，见图3。模型组脑组织切片中可见海马CA1区神经细胞排列紊乱、稀疏，染色浅，尼氏体颗粒小，数量少。心脑舒通56 mg/kg组脑组织切片中可见海马CA1区尼氏体染色较深，颗粒大且多见，细胞排列整齐，接近正常。对其神经细胞的数目进行统计可以看出，模型组比对照组神经细胞数目明显降低（P＜0.01），给药后心脑舒通56 mg/kg组较模型组神经细胞显著性增加（P＜0.01），心脑舒通14 mg/kg组也有增加趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。

3.4 心脑舒通对VD呆大鼠GFAP和Iba-1表达的影响 采用SABC免疫组化法来探究心脑舒通胶囊对星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞Iba-1表达的影响，结果表明，模型组大鼠海马CA1区GFAP和Iba-1表达明显增多，细胞深染，突起变长、增粗和分支增多，见图4。而心脑舒通给药组GFAP和Iba-1表达减少，细胞染色较浅，突起细短，从而证明心脑舒通胶囊能抑制缺血损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化，抑制GFAP和Iba-1的表达。

4 讨论

VD是指各种脑血管病引起脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征，是仅次于阿茨海默氏病的第2位的最常见痴呆[7]。然而由于生存环境、生活方式、体质差异等原因，也有报道称在亚洲及许多发展中国家，VD视为老年性痴呆的首发原因[8-9]。VD的主要临床症状为记忆力减退和认知功能障碍，这与大脑海马区的功能相关。海马区神经细胞的损伤死亡是导致VD的主要原因，所以神经细胞损伤后的修复对VD的治疗具有重大的意义。小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，具有免疫防御和炎症反应[10]，在生理条件下，休眠的小胶质细胞有平衡神经系统和支持神经细胞的重要作用。抑制小胶质细胞过度活化所引起的炎症反应可以作为治疗和缓解神经退行性疾病和脑损伤的重要途径之一[11-12]。星形胶质细胞具有支持、营养神经细胞的作用，但在脑缺血的病理状态下，星形胶质细胞被激活后产生大量的一氧化氮、白细胞介素-6等细胞毒性因子，而引起神经元的损伤[13-14]。所以在脑损伤后抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的过度表达，对脑损伤后的恢复具有重要意义。心脑舒通胶囊的主要成分为蒺藜总皂苷，具有舒利血脉、平肝解郁、活血祛风的药理作用，现代研究发现蒺藜皂苷具有降血脂、改善脑循环，保护缺血脑组织的作用等[15-16]，临床多用于脑中风后的恢复等心脑血管疾病。

图3 心脑舒通胶囊对VD大鼠脑组织病理损害的影响Fig.3 Effects of XNST on VD rats of neuronal cell count in hippocampus

图4 心脑舒通对VD大鼠GFAP和Iba-1表达的影响Fig.4 Effectsof XNST on VD ratsof the expression GFAP and IBA-1 of the hippocampus

本研究表明，心脑舒通胶囊能显著提高VD大鼠的学习和记忆能力，心脑疏通能明显降低大鼠的水迷宫逃避潜伏期，明显增加在定位巡航阶段穿过平台的次数。海马CA1区尼氏染色表明，心脑舒通胶囊能改善神经细胞的形态和活力,促进神经细胞再生。此外，心脑舒通能降低星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化，抑制GFAP和Iba-1表达。这些结果为心脑舒通胶囊对VD大鼠的神经保护作用及部分机制提供理论依据。

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