蚓激酶的提取工艺改进研究*

涂清波，苏鹏亮，林 颖，陆冬莺，王赛男，马宇凡，徐 丹

蚓激酶又称蚯蚓纤溶酶，1983年由Mihara等[1]首次从蚯蚓中提取分离出来。2010版药典标准定义为：系人工养殖的赤子爱胜蚓中提取制备的一组蛋白水解酶。分子量20～40 KD、等电点3～5，在60℃以下非常稳定，最适活性在pH7～9。兼有激酶和纤溶酶两种作用，可直接水解纤维蛋白和凝血因子Ⅰ，选择性激活血块纤溶酶原，抑制血栓素等，为第三代溶栓药，具有溶栓作用强、不良反应小、患者易耐受、半衰期长等特点[2-5]。目前制备蚓激酶的方法主要是从新鲜蚯蚓中经硫酸胺沉淀法粗分离和葡聚糖凝胶-离子交换层析法的纯化得到蚓激酶，缺点是在生产上使用大量的硫酸胺，后处理除盐非常困难，工业除盐的主要方法为透析层析等，导致操作工艺复杂、周期延长、活性下降[6-9]。本文以蚓激酶活性为指标对提取工艺进行改进。

1 材料

1.1 仪器 2-16型冷冻离心机（Sigma公司）；分部收集器（上海沪西分析仪器厂）；DS-1高速组织捣碎机（上海右一仪器有限公司）；冷冻干燥机（上海豫明仪器有限公司）；电子分析天平和pH计（梅特勒托利多仪器有限公司）。

1.2 药材、对照品与试剂 赤子爱胜蚓（汇丰蚯蚓养殖基地）；Sephadex G-75和DEAE-Sepharose FF（上海安妍生物有限公司）；蚓激酶，凝血酶和牛血纤维蛋白原对照品（中检所）；其他常用试剂为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 酶活测定

2.1.1 标准品溶液的制备 取蚓激酶标准品，加0.9%氯化钠溶液制成浓度分别为1 mL中含10 000、8 000、6 000、4 000、2 000 单位的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取供试品适量，加0.9%氯化钠溶液稀释成标准曲线范围内的浓度。测定法：将已加热的琼脂糖溶液39 mL，纤维蛋白原溶液39 mL和凝血酶3 mL，混匀，倒入直径14 cm的培养皿中，室温放置1 h，打孔进样。每孔加样品10μL，于37℃恒温放置18 h。测量溶圈的面积。以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，蚓激酶标准品溶圈两垂直直径乘积的对数为纵坐标，计算标准曲线回归方程。将供试品溶圈两垂直直径乘积的对数代入回归方程Y=1.211X+1.566（R2=0.995），计算供试品效价单位数[10]。

2.1.3 蛋白含量 取本品约20 mg，精密称定，照氮测定法，将结果乘以6.25，即为供试品中蛋白含量，并计算每1 mg供试品中的蛋白毫克数。比活力=每1 mg供试品中效价单位数/每1 mg供试品中蛋白的毫克数

2.2 提取方法的选择 蚓激酶主要提取方法有[7-9]：生理盐水提取法，蔗糖溶液提取法，乙醇提取法和缓冲液提取法。本实验以酶活为指标对此4种方法进行考察。提取流程为：取20 g经洗净泥土和清水浸泡2 h的新鲜蚯蚓，匀浆，常温下加2倍量不同提取溶剂（0.9%氯化钠溶液，10%蔗糖溶液，75%乙醇溶液，pH 7.8磷酸缓冲溶液）匀浆20 min后，10000 r/min低温离心，上层清液过透析袋（35 KD）透析，得到蚓激酶母液，检测酶活。由表1可知，缓冲液提取法提取蚓激酶活性较佳。

表1 蚓激酶的提取Tab.1 Extraction of lumbrokinas μ/mg

2.3 粗分离方法的选择 蚓激酶粗分离的主要方法有[9-10]：热沉淀法，乙醇沉淀法，丙酮沉淀法和硫酸胺沉淀法。以酶活为指标对此4种方法进行考察。

2.3.1 热沉淀法 将蚓激酶母液在60℃保温1 h，离心，上清液冷冻干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.2 硫酸胺沉淀法 将蚓激酶母液加硫酸胺调至饱和度70%，放冰箱冷藏过夜，离心，沉淀物透析除盐，冷冻干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.3 丙酮沉淀法 将蚓激酶母液加入一定量冷丙酮析出，放冰箱冷藏过夜，离心，沉淀物冷冻干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.4 乙醇沉淀法 将蚓激酶母液加入一定量冷乙醇析出，放冰箱冷藏过夜，离心，沉淀物冷冻干燥得到蚓激酶粗酶。

由表2可知，硫酸胺沉淀法，丙酮沉淀法和乙醇沉淀法粗分离效果较佳，但硫酸胺法需要透析除盐，时间周期长；丙酮为低闪点溶剂，不适合工业化生产；乙醇为第3类溶剂且成本低易回收，故选用乙醇沉淀法。

2.4 乙醇沉淀法的改进 乙醇沉淀法是根据乙醇使蚓激酶母液的介电常数降低，增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促使酶析出，酶活主要影响因素为乙醇含量。

2.4.1 乙醇含量因素考察 按照乙醇沉淀法，考察乙醇含量为30%、45%、60%、75%、90%对酶活的影响。由表3可知，蚓激酶的活性随乙醇含量增大而提高，说明乙醇含量越大蚓激酶析出越多。低乙醇含量时活性小于母液，说明低乙醇含量时杂蛋白析出较多。在45%～60%时上升坡度最大，75%～90%时趋于最大点，说明45%时析出杂蛋白最多，75%时析出蚓激酶最多。

表2 蚓激酶的粗分离Tab.2 Coarseseparation of lumbrokinas μ/mg

表3 乙醇沉淀法中乙醇含量的影响Tab.3 Effect of alcohol precipitation on wineaccuracy μ/mg

2.4.2 乙醇分级沉淀法 将乙醇投入蚓激酶母液中，控制乙醇含量为45%，冷藏过夜后离心，取上清液用乙醇继续调节乙醇含量75%，冷藏过夜后离心，沉淀物冷冻干燥得到蚓激酶粗酶，酶活为7 438μ/mg，优于改进前乙醇沉淀法及其他3种分离方法。

2.5 粗酶纯化方法的改进 蚓激酶的纯化工艺主要是先后经葡聚糖凝胶层析和离子交换层析和亲和层析等，层析柱用的最多的是Sephadex G-25，Sephadex G-75 和 DEAE-Cellucose-52，DEAESepharose FF。

2.5.1 纯化方法的选择 将粗酶用pH7.8磷酸缓冲液溶解，过葡聚糖凝胶柱（16 mm×960 mm），缓冲液淋洗，活性组分的洗脱液再过离子交换层析柱（16 mm×200 mm），先用0.1 mol/L的食盐水淋洗，再用0.1～0.6 mol/L食盐水进行梯度洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得到蚓激酶。如表4所示，Sephadex G-75与DEAE-Sepharose FF层析方法的纯化效果较好。

表4 粗酶的纯化Tab.4 Purification of crude enzyme μ/mg

2.5.2 纯化工艺的改进 调换层析工序，将凝胶层析放到离子交换层析的后面进行。流程为将粗酶用pH7.8磷酸缓冲液溶解，过DEAE-Sepharose FF（16 mm×200 mm），先用0.1 mol/L的食盐水淋洗，再用0.1～0.6 mol/L食盐水进行梯度洗脱，活性组分的洗脱液再过 Sephadex G-75（16 mm×960 mm），用清水洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得到蚓激酶，酶活为 28 000μ/mg。

3 讨论

以赤子爱胜蚓为原料，采用的缓冲液提取、乙醇分级沉淀、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析、干燥等工序，制得蚓激酶比活为28 000μ/mg，优于旧工艺。

乙醇分级沉淀法是根据不同浓度的乙醇具有析出不同蛋白质的原理，从分离后蚓激酶的活性来看，进一步说明了低浓度乙醇会析出大量杂质，高浓度则析出蚓激酶。本文经单因素实验粗略选取了乙醇含量为45%作为析出杂质最优点和乙醇含量为75%作为析出蚓激酶最优点，未考察交叉因素的影响，经优化实验设计可进一步得出最佳工艺。

蚓激酶的分子量为20～40 KD，Sephadex G-75和DEAE-Sepharose FF的分离范围为3～80 KD，从结果上可以看出，纯化Sephadex G-25和DEAECellucose-52对蚓激酶的纯化。凝胶层析具有脱盐纯化的作用，将Sephadex G-75放到最后有利于酶的纯化。

目前工业生产蚓激酶的方法主要参照权利专利CN102242099B，经提取、超滤、硫酸胺沉淀、Sephadex G-25和DEAE-Cellucose-52分离制备，本法无需盐析、超滤、透析等繁琐而长周期工序，简化了操作步骤，适合工业化生产。

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