美国FDA对基于NGS技术检测疑似遗传病lVD的监管及启示

吴传松 史裕英 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心 （北京 100044）

内容提要： 目的：探讨美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）对基于NGS平台检测疑似遗传病IVD的性能评价要求，为我国相关从业人员提供参考和借鉴。方法：通过介绍FDA发布的涉及NGS平台检测疑似遗传病IVD研究的指导原则，了解FDA对NGS平台检测疑似遗传病IVD的评价要求，从而在此方面为我国相关监管部门起到借鉴作用。结果：相关监管部门在评价基于NGS平台检测疑似遗传病IVD时，需考虑采用更加创新灵活的技术审评方式并注重产品在设计、开发和验证各环节研究和评价方式。结论：我国目前没有同类指导原则，相关监管部门可借鉴FDA评价基于NGS平台检测疑似遗传病IVD研究的经验，结合我国相关法规要求和实际情况，期望对促进我国同类产品的研究与监管模式能有所帮助。

新一代测序技术的基因组检测可以一次检测几十或百万个DNA变异体，并有可能检测到以前未识别的变异体，而传统的检测方法通常是检测与某一疾病或病症相关的有限数量的分析物。目前临床中，该类产品在肿瘤相关突变检测、遗传性疾病、无创产前检测以及胚胎植入前遗传学诊断等领域备受关注，针对该类产品特点以及促进新技术的发展应用需求，需要建立科学合理的监管方法来评价这类检测的新颖性和灵活性。近年来，FDA一直在探索更灵活、有效、合理的监管方式，2013年FDA批准了基于NGS测序平台的Illumina MiSeqDx囊性纤维化基因检测试剂和MiSeqDx囊性纤维化测序分析仪。2014年，FDA开始发布关于基于NGS技术的检测产品的监管模式的讨论性文件，此后又多次召开相关的研讨会，也有少量基于NGS检测技术相关的产品获批。

FDA希望通过行业标准，质量体系控制和临床专家共识等规范对该类试剂的研发和验证，在保障其安全性和有效性的基础上，简化上市前审查流程。为实现这一目标，2018年4月FDA发布了基于NGS技术用于辅助检测疑似遗传性疾病试剂的设计，开发和分析的指导原则，概述了该类产品在设计、开发和分析有效性研究过程中的关键考虑因素[1]。该指南主要用于对疑似遗传病患者即具有相关临床症状的人群的检测，不用于健康人体测序、产前筛查、肿瘤突变检测、胚胎植入前检测等领域。本文将从以下几个方面对该指导原则进行介绍。

1.基于NGS测序原理的体外诊断试剂概述

基于NGS测序原理的IVD检测可能包括以下步骤：样本收集，处理和存储、DNA提取、DNA处理和文库制备、序列读取和碱基识别、序列比对/映射、变异体识别和过滤、变异体注释和评估以及检测报告的生成。同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤，申请人需要结合产品设计和临床意义建立特定可接受的评价指标和验收标准。此外，为满足产品特定预期用途，申请人需通过科学和适当的性能研究来确定适用的试剂，消耗品，仪器和软件。基于上述考虑因素，不同NGS检测试剂的设计和工作流程差异均可能导致检测结果不同。FDA建议申请人在检测的开发过程中尽可能早地通过审评前沟通程序讨论其申报产品。

2.设计、开发和验证要求

作为IVD检测一般原则，申请人应首先定义申报产品的预期用途和检测性能，产品的预期用途将直接影响检测设计和检测性能以及测序和/或报告的基因类型[2]。申请人需要确定应进行的研究指标（例如准确性）以及每种研究指标应该满足的标准。在设计和开发完成之后，验证研究其是否满足预定义的性能。如果检测不符合任何预定义的性能标准，则应该修改并重新验证。在整个过程中，申请人需要记录所有研究方案，研究过程和结果，以及每项研究设置的理由。

申请人应确定申报产品所适用具体临床适应症，确定满足检测所需的特定用户需求以及可接受样本类型。其中，需考虑到检测的样本类型对测序可能产生的影响，如所需采集工具的类型，样本的最小体积或数量，或其他任何影响样本稳定性的采集因素。多种样本和采集方式可能适用于同一检测，但每种样本和采集方式都需要进行充分验证。确定并记录基因组的检测区域，包括基因和变异体类型，如果关键的测序区域不符合最低性能要求（例如最小覆盖标准），则应修改检测并重新验证以达到最低性能要求。同时，应在产品说明书和/或标签中明确可能影响或限制产品检测性能情形。

检测方法中，需明确所有检测要素（例如，仪器、软件、消耗品、试剂）和用于检测的实验室设备的检测要素[3]。确定设计方案和标准并详细记录设计研究过程。在某些情况下，检测设计问题可能在预定义的性能验证过程中被发现，申请人需修改产品说明书明确因测序平台选择而造成的限制因素。

申请人需选择合适的测序平台、质控品和参考品以及数据处理和分析流程等。根据测序类型和检测报告的变异体类型选择生物信息流程，并考虑变异体识别和评估流程过程中的限制因素。纳入第三方生物信息学软件的检测设计应通过记录和验证生物信息学软件在NGS的检测环境中的运算表现。详细记录运行检测的过程和方法，每个检测步骤的方法，使用仪器，消耗品，试剂和支持方法的程序。如适用，确认每一步的限制，包括对其他步骤的潜在影响。以及使用的测序类型，例如，单端/双端/配对测序。对于基于NGS的检测所需的每种方法，应确定研究性能和试验过程。

3.分析性能研究

分析性能验证包括通过一组预定义性能评价方式，以证明性能是否足以满足其预期用途并符合预定义的性能标准。通常涉及是否符合统计学评价要求，或检测是否存在关于患者的疾病或其他病症信息的变异体等。

3.1 准确性

准确性包括对比检测值与被检测值之间一致性。对于基于NGS测序原理的检测，通过与FDA确定为适当的对比方法比较，如双向测序或其他经过验证的方法，评估申报产品准确性能。

通过阳性百分比一致性（PPA），阴性百分比一致性（NPA）和技术阳性预测值（TPPV）证明试剂准确性。为PPA，NPA和TPPV设置评价指标，以确保检测满足其预定义的性能范围。通过检测评估的每种类型的变异体（如：SNV、插入、结构变异体）和测序区域范围（如：高度同源、高度多态或其他困难的区域）分别计算PPA，NPA和TPPV。

对于每种变异类型以及临床相关变异体，均应计算准确度。对于变异体类型，为了确定检测的变异体类型以及检测它们的测序区域（不管变异体是否具有致病性），可以使用具有代表性的参考物质或具有高置信度的样本进行研究。对于临床相关的变异体，准确性计算包含使用基于临床样本的研究数据与临床样本相关的指标。

根据检测的性能指标，准确性研究应包括代表性变异体和变异体类型。研究应考虑与检测适应症相关的临床意义区域、跨不同基因组的变异体、基因组难以测序或难以辨识的区域、嵌合体以及任何其他变异体类型、区域或被测区域范围等。

准确性研究中应含有临床相关变异体与检测适应症的临床样本，以确保临床相关序列变异被检测和报告。准确性评估如采用新鲜临床样本时，收集和处理的方式应与产品预期用途一致。如果新鲜的临床样本不可用，则可以使用临床相关区域中含有特定变异体的冻存临床样本或人类细胞系样本替代或补充研究。特殊情况下，如果FDA认为合适，也可以使用生物合成样品作为可接受的替代样本。

3.2 精密度

申请人应评估变异体和野生型基因的精密度，其中应分别报告不同检测区域和变异体类型的检测指标值。申请人应使用客观证据和有效的统计方法来验证这些指标设定标准。对可能导致检测结果多样性的主要因素进行评价，包括但不限于检测多个样本，不同运行间、不同适用机型、试剂批次、检测天数和操作员。

基于NGS技术的IVD检测的精密度研究主要是指使用相同的样本（包括检测临界值附近的样本）在各种特定条件下进行检测（如不同操作员，不同操作条件，不同检测天数，不同仪器等），并考虑了检测中主要的变异来源。此外，在外部因素相同的情况下，应进行申报试剂在相同或相似被测物的重复性检测以评价检测结果的变异程度。申请人需对每个检测条件和检测区域下每个变异体类型精密度分别进行报告，还应报告没有应答或无效应答的百分比。

3.3 最低检出限

明确可接受的最低检测范围，并明确无效检测或无应答检测结果可接受标准。为预期用途中包含的每种变异体类型建立LoD。如果检测混合的样本（如嵌合样本），需要考虑不同的等位基因比率，确定检测下限。

试剂LOD的研究中应在不同的常规临床实验室条件和确定的样本类型下进行。通常，LOD值被确立为具有至少95%的阳性检出率和可接受水平的无效的或未检测到的检测水平。当不同的变异体类型可能具有不同的LoD时，需要计算不同的序列被测区域范围中的每个变异体类型的LoD。

3.4 分析特异性

分析特异性是评估产品仅可检测到预期待测变异体的能力。根据预期用途和产品设计，一些潜在的内源性或外源性物质干扰和交叉反应或交叉污染可能会对产品检测性能产生影响。交叉反应（如同源区域，假基因和其他类型的交叉反应序列）可能导致错误检测，从而产生假阳性结果。患者标本的交叉污染可能将其他不正常的序列引入到检测中，从而导致假阳性或假阴性结果。因此，应选择产品预期用途所覆盖样本或样本类型以及DNA提取方法中相关的干扰物质开展研究。同时，应对已知交叉反应的等位基因和同源区域进行评估。此外，需要评估患者样本之间的携带或交叉污染。特别注意的是，对于如WES类的检测产品，考虑到许多基因区域在任何两个样本中都是相同的，可能需要对样本之间的已知差异进行交叉污染评估。

4.检测运行质量指标

明确设计和检测过程有关的覆盖率，碱基质量和其他检测运行质量指标的最低可接受标准。设置样本和变异体质量控制验收标准，如reads数量，覆盖率，评价标准。

检测运行质量指标用于判断是否某个检测运行、样本或变异体识别可以被接受，或者在适用时确定是否应增加补充研究进一步确认变异体识别。检测运行质量指标验证应包括具有临床意义的基因组检测，即有足够证据证明致病变异体和疾病之间存在因果关系的基因和区域。此外，不能满足检测标准的变异体不应该被报告。FDA强调应明确样本的接收和剔除标准、DNA浓度、加样体积、质量阈值等。并如实报告那些由于未能达到质量阈值而未被检测的区域。

5.其他性能评估研究要求

FDA在基于NGS测序原理的IVD性能评价时，还强调了一些值得特别关注的测序区域。对预期用途代表性的基因组区域，变异体类型及序列等进行验证性研究，包括临床相关目标基因。如产品预期用途包含需要检测高度同源的、高度多态性的或其他检测难度较大的区域，申请人应对这些区域进行验证。同时，对于某些变异类型，如大于某特定大小的插入或缺失突变或者重排，应评估其检测限制性。并确定检测无法以预期的准确度和精密度检测到的序列变化类型，研究中应使用可以反应真实待测的样本类型。

确定所需样本的数量和类型，以证明满足预期用途的性能标准。样本数量取决于申报产品的预期用途，被检测和报告的变异体数量和类型，以及为支持该预期用途而必须满足的关键性能参数。此外，还应对预期用途相关的不同基因型（即野生型，杂合型，嵌合杂合型，纯合型）的检测性能进行评估。尽管没有要求需要检测某特定数量的基因组，或者来自不同患者的特定数量的样本，但样本的数量和类型应该在统计学上证明可代表检测的临床适应症和变异体类型。

当临床样品、细胞系或生物合成材料不可用时，也可用计算机模拟构建包含产品声称的各种类型的已知序列，以作为生物样本的补充，用于评估生物信息过程。但是，这些数据文件应来源于采用与检测相同的预分析和检测方法中，并详细描述人工序列构建的方式。

6.启示

6.1 多渠道促进NGS评价标准建立

美国FDA在NGS产品性能评价过程中非常关注性能标准的建立和确认过程，并鼓励临床专家，行业专家与美国FDA共同探索建立NGS的评价方法，这为我国探索建立NGS性能标准提供了一种参考途径。同时，根据产品特点可能需要涵盖多种基因和变异体类型，但部分基因和变异体临床突变丰度较低，如何有效收集代表性临床样本以及在何种情况下，可以采用其他来源样本进行验证等问题均需要进行科学的评定。因此，鼓励临床专家、行业专家跟审评部门合作建立符合国内临床应用情形的NGS分析性能评价方法，鼓励企业与临床机构，科研单位积极合作，建立能够反映产品特性的性能评价标准。

申请人在研发该类产品时，应综合该产品临床意义、性能特征等因素预定义该类产品预期用途和适用人群，因为分析性能项目的设计与上述因素关联性较强；FDA在审评该类产品时，也特别强调分析性能评估的设计应结合该产品的预期用途及适用的人群，使分析性能评估指标制定和评价更加贴近于临床应用。

6.2 强化沟通交流机制

美国FDA在评价基于NGS测序原理的IVD时，强调申请人在设计，开发和验证过程中应与FDA积极进行沟通与咨询，FDA也在审查要求中明确部分指标应经FDA确认，如准确度方法学比对的方法选择。尽量避免申请人选择不合适的评价方法。2017年，国家食品药品监督管理总局全面推进医疗器械审评审批机制改革，贯彻落实中共中央办公厅、国务院办公厅印发《关于深化审评审批制度改革鼓励药品医疗器械创新的意见》（厅字[2017]42号），强化审评质量管理体系建设，不断提高审评审批质量和效率。目前家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心也启动了创新、优先等审评前沟通交流机制[4]。在国家深化审评审批制度改革背景下，更优化，更高效的审评沟通交流举措将值得期待。

6.3 FDA监管理念变化的启示

NGS基因组检测建立在越来越多的数据和快速发展的技术基础之上，基于NGS技术的检测基因数量也在不断变化。需要科学合理的监管方法来评价这类检测的新颖性和灵活性。目前的监管方法适用于检测与疾病或病症相关的有限数量的预定义分析物的常规检测，因此FDA考虑在保证该类产品安全性和有效性的前提下，采用优化的方法来监管基于NGS测序原理的检测试剂，以支持快速发展的新技术在基因组医学的应用。

美国FDA针对NGS测序技术特点，采用一种不同于传统局限于有限被测物的检测方法，采取灵活的，更加开放态度的监管手段，为我国同类产品技术审评提供了参考价值。我国对测序技术运用在生物领域非常重视，科技部2018年5月科技部制定了《“十三五”生物技术创新专项规划》在重点任务的颠覆性技术部分，明确指出发展新一代基因测序技术，重视单分子技术在其中的应用和测序数据的分析解读。

对于基于NGS技术的IVD产品，优化医疗器械审评工作方式是摆在医疗器械审评部门的一个重要课题，借鉴各国医疗器械审评机构的审评实践经验，并对这些信息资源积累和利用是提高医疗器械注册审评工作质量和效率的一个重要途径[5]。目前我国还没同类指导原则发布，且没有基于NGS原理检测疑似遗传病的IVD产品上市。在当前情况下，通过解读和利用FDA的该项指导原则希望对我国NGS产品注册审评的具体研究和监管有所启发和借鉴。