食用植物油DNA提取和检测研究进展

王鸣秋，李诗瑶，刘 艳，杨 硕，马 弋，高 冰*

（1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430000；2.湖北工业大学 轻工学部，湖北 武汉 430000）

随着我国对食用植物油日益增长的消费需求，其产品呈现多样化、层次化和细分化的局面，市场上流通各种植物油品类，包括大豆油、花生油、芝麻油、玉米油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油、植物调和油等[1]。但良莠不齐的生产厂家为追求暴利，给食用油安全带来了诸多隐患。其中最突出的问题表现在三个方面，一是植物源性成分的掺假，以廉价油冒充或勾兑高价油，二是转基因油料作物的标识，三是地沟油的问题[2]。这些问题一方面对人们的身体健康造成了安全隐患，同时也损害了消费者的利益，扰乱了市场秩序。因此，食用植物油的检测成为解决安全问题、打击食品犯罪的重要手段。

目前，常用的食用植物油掺假检测方法主要有理化分析法和分子生物学检测方法。前者主要是利用色谱和质谱技术对食用油中脂肪酸、甘油三酯、植物甾醇等特征性指标组成和含量的差异进行测定，从而鉴别油脂的真实性[1]，但是产地、品种来源、加工程度不同的食用植物油特征性指标具有一定差异，加之现有研究仅限于单一源性的掺伪鉴别[3]，因此该方法具有适用局限性。近年来红外光谱[4]、拉曼光谱[5]、核磁共振[6]技术也逐渐应用于食用植物油的真实性鉴定中，但均需建立有效的数据库并对数据统计分析才能用于实际样品定性定量识别。

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）在细胞内普遍存在，性质稳定，能够直接反映植物油原料的真实性[7]，以DNA为靶标的食用油检测技术比理化分析技术更加稳定，且灵敏度和准确性更高[8]，尤其是转基因成分主要依赖DNA检测，因此得到越来越广泛的应用和发展。DNA检测技术的首要步骤是DNA的提取，然而食用植物油的深加工处理严重影响了DNA的完整性和含量[9]，而且提取液中残留的多糖和酚类化合物还会抑制DNA聚合酶的活性导致扩增不稳定[10]，给后续检测带来极大困扰。自1998年PAULI U等[11]报道从粗制大豆毛油中成功检测到DNA后，相继有关于从初榨植物油提取和扩增DNA的研究报道。但市售食用植物油经过高温高压精炼处理后，DNA降解更严重，提取难度更大[12]。随着研究工作逐步深入，精炼油的DNA提取技术也不断发展，DOVERI S等[13]能够从商业葵花籽油和玉米油中扩增DNA，COSTA J等[14]用试剂盒法从完全精炼的植物油中扩增到大豆DNA。随着分子生物学技术的不断发展，聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR）扩增检测技术灵敏度和准确性随之提高，给食用植物油掺假、品种溯源等检测带来了新的机遇。

本文主要从DNA提取和检测技术两方面介绍食用植物油DNA检测研究进展，结合应用实例对各方法进行综合评价，并对未来研究方向和前景进行展望，以期为后续深入研究提供思路。

1 食用植物油DNA提取

1.1 食用植物油DNA提取技术

1.1.1 试剂盒法

PAFUNDO S等[16]利用Nucleospin Plant kit成功提取初榨橄榄油中DNA并用于扩增片段长度多态性分析；INNOCENZO M等[17]利用QIAamp DNA stool试剂盒成功提取初榨橄榄油中的DNA并用于微卫星分析。一些研究通过对比试剂盒法和其他方法的提取效果，发现前者更有优势。BRETON C等[18]对比了二氧化硅法、羟基磷灰石法、Wizard MagneticDPSF法、十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS）法等多种方法对橄榄油DNA的提取效果，虽然所述4种方法均可用于植物rbcl基因和微卫星扩增分析，但WizardMagneticDPSF法提取DNA得率最高；王德莲等[19]利用Wizard Magnetic DPSF法、进出口行业标准SN/T 1203—2010《食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法》、十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法和SDS法提取大豆原油和精炼油的DNA，结果表明，4种方法均能成功提取大豆原油DNA，但只有前两种方法能够提取精炼油DNA，且Wizard试剂盒成功率为67.3%。

虽然试剂盒法在提取效率和产物纯度方面具备优势，但由于食用植物油DNA提取时起始样本用量为一般植物样本的几十、上百倍，导致DNA裂解液等试剂大量消耗，提取成本急剧增加，且大部分试剂盒适用于小量提取，这从一定程度上制约了该法的应用。

1.1.2 CTAB法

CTAB法自成功用于植物基因组DNA提取后，因其低成本、提取效率高的优势逐渐发展为最常用的核酸提取技术之一[20]，而经过改良的CTAB法在食用植物油DNA提取中也得到广泛应用。王亚[21]通过加入乳化富集、酚氯仿反复抽提，异丙醇与醋酸铵共沉淀等步骤对传统CTAB法进行改良，同时比对高盐低pH法、碱裂解法、氯化苄提取法、试剂盒法、改良SDS法等6种方法的提取效果，结果显示改良CTAB法效果最好，最高产率可达到41.2 ng/μL；RAMOS-GOMEZ S等[22]从裂解液成分和比例、裂解时间、沉淀时间三个方面优化提取方法，通过定量PCR扩增rbcl和rnl基因检测提取效果，最终建立改良CTAB法，实现了对精炼植物油的DNA提取；BUSCONI M等[23]通过提高裂解液中CTAB浓度至10%，并用氯仿/辛醇代替氯仿/异戊醇抽提蛋白，成功提取橄榄油中DNA并用于品种溯源。

CTAB法虽然操作复杂耗时，但相较于试剂盒法应用更加灵活，所有提取步骤和试剂均为开放式，研究者可根据提取对象对实验试剂和条件进行改良，加之其成本低廉，特别适合大量提取，对于食用植物油DNA提取来说，其应用价值仅次于试剂盒法。

1.1.3 SDS法

SDS是一种阴离子去污剂，通过在高温条件下裂解细胞，结合蛋白质和多糖，释放核酸实现DNA提取[20]。1998年，HELLEBRAND M等[24]采用SDS法成功提取精炼菜籽油DNA，并用PCR扩增油菜籽内源基因进行验证，这是国外首次报道能够实现对精炼油DNA的提取；姚菲等[25]通过Tris-EDTA（TE）萃取和加入醋酸钠提高盐浓度改良SDS法，使蛋白质和多糖等杂质沉淀更加完全，成功提取了茶籽油DNA并用于定量PCR检测。SDS法操作简单，提取条件温和，在一定程度上避免了提取过程造成食用油核酸的再次断裂，但其DNA产率和纯度均不如上述两种方法，在近年研究中应用较少。

1.1.4 乳化法

最后，根据当前红外图像分析出的可供装甑撒料执行结构执行操作的结果如下.图8中以黄颜色方框人工标记出来可能的撒料区域，共有11个区域.图9为本文所设计算法流程识别出的结果，标记各区域的序号并将撒料区域的质心以黑色空心圆的方式标识在各个区域上，共有6个区域.

乳化法作为一种样品的前处理方法能够实现核酸富集，显著提高了食用植物油DNA提取效率。研究中最常用的乳化剂是正己烷。NIKOLIC′Z等[26]以1∶10的比例将大豆油和正己烷进行混合并乳化，分别采用CTAB法和DNeasy Plant试剂盒提取DNA，结果表明试剂盒法提取的产物对PCR反应抑制作用弱，可成功用于转基因成分的定量检测；RAIETA K等[27]以相同比例混合正己烷、橄榄油并进行乳化，后续采取CTAB-氯仿法进行提取，结果表明该方法重复性较好，产物适用于微卫星分析。此外，也有用氯仿[28]、石油[29]等代替正己烷作为乳化剂的报道，结果均可实现对食用植物油DNA的提取和扩增，不过尚未有不同乳化剂对提取效果影响的数据。虽然有机试剂乳化法受到很多学者的青睐，但对提取的作用说法不一，如TESTOLIN R等[10]报道使用正己烷乳化并未提高DNA提取效率，所以乳化法在食用植物油DNA提取方向的应用效果有待进一步研究。

1.1.5 担体法

担体法是通过在核酸提取时添加与样本亲缘关系较远的动植物核酸作为担体，在提高核酸提取效率的同时，又不影响检测结果的方法。蔡翠霞等[30]以鲑鱼精子DNA作为担体，建立了硅膜吸附柱法用于食用植物油DNA提取，并通过PCR检测内标基因作为验证；GIMÉNEZM等[31]采用改良CTAB法提取橄榄油DNA时，发现在沉淀DNA前加入线性丙烯酰胺作为担体，显著提升了DNA回收率。此外，食用植物油DNA提取的改进还包括样品上清重复离心[32]，核酸助沉剂辅助[33]、冷冻干燥法[34]等。

1.2 影响DNA提取效率和质量的因素

食用油DNA残留量与原料品种、原料处理方式、加工工艺、储存条件和时间等密切相关，因此DNA提取效率都不尽相同[35]。原料不同的食用植物油成分不同，如蛋白含量、脂肪酸的饱和度、色素和游离脂肪酸含量等；即使是同种食用油，不同品牌、产地、批次以及新鲜程度等都会对食用植物油的组成产生影响[15]。RAMOS-GOMEZ S等[22]发现CTAB裂解液成分、作用时间及DNA沉淀时间对葵花籽油、橄榄油和棕榈油3种油DNA产量的影响存在差异，如较长的沉淀时间可增加葵花籽油和橄榄油的产量，但棕榈油产量却大幅下降，推测与棕榈油本身复杂的特性有关。

食用油的生产工艺也是影响DNA提取的关键因素。市售植物油的加工工艺主要为压榨和浸出，其中压榨又分为冷榨和热榨两种，冷榨技术不包含离心和过滤操作[35]。PAULI U等[11]发现离心后的大豆毛油未检测到Lectin基因，说明离心操作严重影响了DNA含量；BUSCONIM等[23]提出冷压榨技术生产的橄榄油DNA提取效率高，且更有利于后续品种溯源检测。另外，经过压榨或浸出的毛油到市售食用植物油还要经过一系列精炼过程，包括过滤、脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱蜡、脱致癌物等，这些步骤都会不同程度的降解甚至去除油中的DNA[35]。除此之外，食用植物油的储存时间、温度、光照等都会影响植物油的氧化程度，从而影响DNA的含量。

2 食用植物油DNA检测方法

基于DNA的食用植物油检测技术主要用于植物油掺假检测、转基因成分检测和油脂的追踪溯源，由此发展起来的检测技术有PCR技术、分子标记技术、环介导等温扩增技术、生物芯片技术等，其中以前两种技术应用为主。

2.1 PCR技术

对于食用植物油的PCR检测技术而言，除模板DNA的质量和浓度外，靶标基因的选择也会直接影响结果的成功与否。研究表明，植物油PCR检测中能够扩增的片段通常不超过300 bp[10]，转基因片段不超过150 bp，因此靶标基因片段越小，PCR扩增成功率越高[24]，同时GC含量也可作为靶标选择参考条件之一，因为高GC含量的DNA在加工中更稳定[36-37]；另外，植物油中质体/叶绿体DNA比细胞核DNA更容易被提取，因此针对质体/叶绿体基因设计靶标引物也是一种研究策略[38]。

普通PCR技术是食用植物油DNA检测中的常用技术。NIKOLIC′Z等[26]利用普通PCR扩增出大豆油中转基因成分EPSPS基因（172 bp），灵敏度达到0.1%（转基因成分质量分数）；杨冬燕等[39]将廉价植物油和高价植物油以不同比例（1∶1或2∶1）混合，利用普通PCR测定廉价油物种特异性基因，结果表明，廉价油以2∶1掺入时检出率较高，但掺假量低于50%时其鉴别能力不足。虽然普通PCR灵敏度高，但其耗时长，需要结合电泳技术进行分析，分辨率低，容易受到PCR抑制因子的影响，且无法对靶标进行定量，因此在很大程度上限制了其在食用植物油检测中的应用。

巢式PCR是在普通PCR基础上发展起来的一种灵敏度高、特异性强的DNA检测技术，它利用两对嵌套引物，先用外引物扩增后，以其扩增产物为模板进行内引物二轮扩增，实现对微量模板和强干扰背景体系的分析，特别适用于模板含量极低的食用植物油DNA检测[35]。HELLEBRAND M等[24]利用巢式PCR扩增出精炼菜籽油中油菜籽内源基因PE3-PEPcase，可用于菜籽油掺假检测和转基因检测；姚芹等[40]建立了单管巢式PCR扩增转基因大豆内源基因Lectin和外源基因CP4-EPSPS的方法，可弥补常规巢式PCR容易污染和操作繁琐的缺点。

实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，利用荧光信号累积实时监测PCR进程，结合标准曲线分析产物，计算未知模板初始浓度的一种检测技术[41]。该技术能够对食用植物油各种植物源成分和转基因成分进行定量检测，比普通PCR灵敏度高，特异性和重复性好，且无需后续处理，较好地避免了交叉污染。ZHANG L等[42]根据油棕特异性基因MT3-B设计引物和探针，用于普通PCR和荧光定量PCR检测棕榈油DNA，两种方法检出限均低至5个拷贝；王德莲等[43]利用qPCR法对掺有大豆油和棕榈油的花生油进行检测，发现掺伪（大豆油或者棕榈油）比例达到10%时，即可检测到掺伪油的内源基因；蔡翠霞等[30]分别用两轮PCR法、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法和qPCR法测定了13种植物油的转基因启动子CaMV35S，其中qPCR检测到7种为阳性（Ct值＜35），与样品转基因标识一致。

RT-qPCR是食用植物油DNA定量最可靠的技术之一，但其定量基于特定生成的已知浓度标准曲线，依赖于PCR的扩增效率，可能导致放大偏差和错误。近年来，数字PCR（digital PCR，dPCR）逐步应用于医学、微生物学等科学领域，它是一种基于单分子目标基因扩增定量的技术，核酸模板被分配到大量独立的反应单元中，扩增结束后通过统计学分析单个反应室的阳性信号，从而实现绝对定量[44]。相较于qPCR，dPCR技术不依赖于标准品和标准曲线的绘制，消除了样品基质对Ct值的影响，具有检出限低、重复性好等优点。SCOLLO F等[45]利用qPCR和dPCR评估4种提取方案对橄榄油DNA提取效果，两种PCR评估结果一致，均表明CTAB-离心柱法是最有效的方案，Nucleospin plant试剂盒重复性更高，但微滴式dPCR（10-3）比qPCR（10-2）的分辨率低一个数量级。可见，对于食用植物油这种DNA含量极低的样本，dPCR检测技术具有更大的优势。

2.2 分子标记技术

分子标记是能反映生物个体的遗传物质中某种差异的特异性DNA片段，主要应用于植物油原料品种鉴定和追踪溯源上[46]。橄榄油作为高价植物油，其原料品种和产地很大程度上决定了油脂的品质，因此在植物油溯源分析中的研究最多。应用的主要技术包括：随机扩增多态性DNA randomly amplified polymorphic DNA，RAPD），内部简单重复序列（inter-simple sequence repeat，ISSR），扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、微卫星、序列特异性扩增区域（sequence-characterized amplified region，SCAR）和单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）等。

20世纪90年代后期，非特异性分子标记（RAPD、ISSR）率先被应用于橄榄油品种溯源中，但是由于油中DNA高度降解和PCR抑制物的存在，鉴定结果缺乏可重复性[47]。通过改进DNA提取方法，重复性问题得到解决，但研究发现同一栽培品种的橄榄油和其叶片获取的扩增谱不完全一致，特别是对于较长片段更是如此[48]。SCAR标记的建立在一定程度上改善了不一致的问题，PAFUNDO S等[49]将短片段AFLP（50～150 bp）转换为特异性SCAR标记成功扩增出橄榄油DNA，完成品种溯源鉴定。因此，使用分子标记追溯橄榄油品种时，推荐选用短片段扩增子（＜200 bp），而微卫星和SNP两种特异性分子标记正好具备这种优势。但是研究者使用核微卫星分子标记进行橄榄油真实性检测时，发现即使缩短目标序列仍然存在叶片与相对应油中扩增图谱不一致的情况，推断与橄榄异花授粉特性相关，于是提出以叶绿体DNA（chloropast DNA，cpDNA）微卫星作为标记靶标。因为叶绿体基因组为母系遗传，可避免因异花授粉导致的不一致问题，同时cpDNA更具抗降解性，拷贝数高，对于橄榄油分析具有显著的优势[50]。第三代分子标记SNP扩增片段小，适用于DNA降解严重的情况，而且其自动化程度较高，能够结合微阵列分析、毛细管电泳等技术实现高通量检测。CONSOLANDI C等[51]结合多重PCR与连接LDR-UA平台，成功利用13个SNP位点实现了对49个橄榄油品种的鉴定。

由此可见，每种分子标记都有其技术优势和缺陷。RAPD和ISSR虽操作简单，成本低，但重复性差[52]；AFLP多态性和可靠性高，但是操作复杂，无法用于混合品种的植物油鉴定；微卫星是应用最广泛的分子标记，多态性高，重复性好，适合建立标准化方案在实验室间用于比对研究，但是标记的构建非常费力、成本也高；SCAR多态性差，只能用于品种间的鉴定；SNP位点丰富、分布广泛，可分辨品种内微小差异，且自动化程度高，但只能用于少数动植物，开发费用高。因此，在单独的分子标记无法完成品种溯源时，可同时运用两种至三种标记共同分析，优势互补，提高分辨率和重复性。

3 结论与展望

基于DNA的分子生物学检测技术准确、快速，为食用植物油检测提供了稳定可靠的结果，但同时又受制于精炼油DNA提取的难题。虽然研究已经证实有方法能够从各种原料的植物油中提取到高质量的DNA并用于后续分子检测，但提取效率和质量与食用植物油品种、加工工艺、储存条件和时间、提取方法等多种因素相关，且现有提取方法各有千秋，所以国内尚未有统一的检测标准研制出来。

日益突出的食用植物油掺假、转基因问题给DNA检测技术在精准定量、高通量检测方面提出了更高的要求，而数字PCR、高通量测序、DNA微阵列等技术的快速发展为应对这些问题提供了解决方案。作为一种终点PCR技术，数字PCR将传统PCR的优点与绝对定量相结合，有效降低了依赖于PCR扩增效率定量的RT-qPCR的错误率，非常适用于DNA含量极低的食用植物油样本和低拷贝数靶标的转基因检测。另外，微卫星、SNP等分子标记也可耦合如高分辨率溶解曲线、DNA微阵列、悬浮荧光微球等技术平台实现高通量食用植物油品种溯源，降低检测成本。

综上，本文提出了未来食用植物油DNA检测研究的方向和重点，以期为后续研究提供思路：一是整合现有食用植物油DNA提取方法，建立通用、操作性强、适用范围广的标准化方法；二是多种技术联用，结合新型分子技术进一步提高DNA检测灵敏度、特异性和通量；三是全面覆盖各品种食用植物油、混合油的鉴定和溯源分析。

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