临床分离万古霉素耐药肠球菌van基因型及分子分型

周 迎， 杨 洋， 郭 燕， 郑永贵， 吴 湜， 徐晓刚

万古霉素耐药肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）已经逐渐成为医院感染的重要病原菌，可引起尿路、腹腔、伤口感染，以及血流感染、心内膜炎等严重感染性疾病。中国大陆地区VRE主要携带vanA和vanM 两型耐药基因簇[1-2]，vanA与vanM耐药基因簇均属于D-丙氨酸：D-乳酸连接酶（D-Ala：D-Lac ligase）基因簇，常介导宿主菌对万古霉素等糖肽类抗菌药物耐药。本研究对2016年分离自上海地区6所医院的17株VRE进行耐药基因及多位点序列分型（MLST）分析，为此类耐药菌感染防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 17株VRE均于2016年分离自上海地区。vanM基因型VRE阳性对照株Efm-HS0661以及质控菌株粪肠球菌ATCC29212均为本研究所保存菌种。vanA基因型VRE参考菌株由香港中文大学凌建华博士惠赠。

1.1.2 主要试剂及仪器 Mueller-Hinton 琼脂、Columbia 琼脂、BHI琼脂及肉汤（OXOID，英国）；阳离子调节MH肉汤（Cation-Adjusted Mueller Hinton II Broth， CAMHB）（BD，美国）。氨苄西林、左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、克林霉素、利奈唑胺、甲氧苄啶-磺胺甲唑、替考拉宁、呋喃妥因和利福平等药敏卡购自温州康泰公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；限制性内切酶TaKaRa Ex Taq、TaKaRa Taq™ HS PCR Kit（UNG plus）及PCR仪购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖、电泳系统及凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌种确认 根据参考文献合成通用引物8F、1492R[3]，扩增17株临床分离VRE的16S rRNA基因，测序后与GenBank序列进行比对，以进一步确认菌种。

1.2.2 药敏试验 采用微量肉汤稀释法测定VRE对氨苄西林、左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、克林霉素、利奈唑胺、甲氧苄啶-磺胺甲唑、替考拉宁、呋喃妥因和利福平的MIC值。采用琼脂稀释法测定磷霉素对VRE的MIC值。根据CLSI 2017版标准[4]对结果进行判读。

1.2.3 DNA模板制备和MLST分型 将冻存菌株转种哥伦比亚血平皿，37 ℃过夜培养后挑取菌落至已注入500 μL TE（pH8.0）的1.5 mL Eppendorf离心管，调节菌液浊度至2麦氏单位，100 ℃ 加热10 min后5 000 g离心5 min取上清液备用。

扩增屎肠球菌基因组上的7个管家基因：AtpA、Ddl、Gdh、Purk、Gyd、PstS和Adk，将PCR产物纯化后测序。参照屎肠球菌MLST分型数据库（http：//efaecium.mlst.net/）提供的步骤进行MLST分型。

1.2.4 van基因分型 参照参考文献进行多重PCR扩增[5]，扩增所需引物见表1。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶，电压6 V/cm电泳30 min后染色读取结果。

表1 本研究所采用的PCR引物Table 1 Primers used in this study

2 结果

2.1VRE临床株菌种鉴定及药敏测定

17株VRE临床株经16S rRNA基因测序确认均为屎肠球菌。常用抗菌药物对17株临床分离VRE的MIC结果见表2。本研究所测VRE对万古霉素及替考拉宁耐药率高，分别为100%（17/17）和70.6%（12/17）；但对于磷霉素和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率低，分别为29.4%和5.8%；所有分离株对利奈唑胺均敏感。

2.2 VRE临床分离株van基因分型

17株VRE中，13株检出vanA基因，9株检出vanM基因，其中5株同时检出vanA和vanM基因，见图1。

2.3VRE临床分离株MLST分型

通过MLST分型，17株VRE中ST78型8株（47.1%）、ST80型4株（23.5%）、ST555型2株（11.8%），其余3株分别为ST117型、ST262型和ST341型。分型结果显示，2016年上海地区分离VRE以ST78型为主。

3 讨论

VRE自1988年首次报道以来[6]，已在全球播散，成为最重要的医院感染病原菌之一。VRE对医院内环境适应性强[7]，且治疗药物有限。VRE的耐药性可通过携带耐药基因的移动元件在肠球菌属细菌中传播，甚至跨种属传播，例如传递至致病性更强的金黄色葡萄球菌，产生万古霉素耐药金黄色葡萄球菌。根据2009年至2012年美国国家医疗安全监测网络（NHSN）数据显示[8]，肿瘤患者血流感染的主要病原菌中，肠球菌（11.4%）仅次于凝固酶阴性葡萄球菌和大肠埃希菌位列第3，其中耐万古霉素屎肠球菌占82.5%。VRE在中国地区耐药率一直较低，但是近年来有逐年增多的趋势。根据2005－2014年CHINET耐药性监测数据显示，屎肠球菌对万古霉素的耐药率由0.6%上升至4.2%[9]。

表2 17株万古霉素耐药肠球菌基因型及其对抗菌药物的敏感性Table 2 Genotypes and antimicrobial susceptibility of 17 vancomycin-resistant Enterococcus strains

图1 van基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of van gene PCR products

根据VRE耐药表型和van基因簇结构的特点，已有9型肠球菌van基因型被命名，分别是vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN[10-11]。它们对万古霉素和替考拉宁的耐药水平各不相同，但是耐药机制相似：通过合成与万古霉素亲和力下降的新细胞壁前体而形成耐药。vanA、vanB、vanD和vanM型介导VRE菌株产生含D-丙氨酸-D-乳酸（D-Ala-D-Lac）末端的细胞壁前体，导致细菌对万古霉素高度耐药（MIC≥64 mg/ L）。国外流行病学数据显示，vanA及vanB型最为常见[12]，但我国分离VRE的基因型有所不同，主要为vanA型，vanB型少见。上海地区vanM较为常见[1-2]。

我们前期已建立一种基于多重PCR技术的VRE万古霉素高水平耐药基因快速分型方法[5]，对2016年上海地区临床分离的17株VRE进行van基因及分子分型。分型结果显示临床分离株中van基因型仅有vanA和vanM型两型，首次发现同时携带vanA及vanM 的VRE菌株。对VRE菌株进行进一步药敏分析，结果显示，17株VRE菌株均对万古霉素耐药，但对替考拉宁耐药率仅为70.6%（12/17）。本研究已对这些VRE菌株的van基因簇进行了初步分析，在van基因簇中发现了一些插入及缺失变异（待发表结果），但这些变异是否会导致细菌对替考拉宁敏感性变化还有待证实。由于携带单一van基因VRE与携带vanA及vanM两型van基因的VRE菌株相比，其耐药表型无明显差异，目前van基因检测方法常不包括vanM基因，故当前国内外van基因分子流行病学研究可能漏检vanM基因，低估vanM型VRE的危害。

总之，2016年上海地区临床分离的VRE基因型仍仅有vanA和vanM 两型，MLST分型显示17株VRE分属6种ST型，提示vanA和vanM 两种耐药基因可在不同属肠球菌株之间进行水平传播。首次发现了同时携带vanA和vanM 2种高水平耐药基因的VRE，携带2种耐药基因的VRE检出率高达29.4%（5/17），值得关注。

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