生物絮凝-罗非鱼养殖系统启动阶段絮体胞外聚合物、粗蛋白和总氨基酸变化

程丽妹， 陈家捷 ，高锦芳 ，罗国芝,2

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306； 2.上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306)

生物絮凝技术 (Bio-floc Technology，BFT)可以通过微生物作用，将养殖过程中产生的养殖固体废弃物(残饵、粪便等)转化成部分养殖对象可摄食的絮体饵料，且对水体中氨氮等有显著的去除效果。在净化养殖水体水质的同时，还可实现饵料的循环利用，是缓解水产养殖业可持续发展所面临的环境制约和资源重复利用的有效技术[1-3]。

养殖过程中，絮体的沉降性能对养殖对象有重要的影响。沉降性能不佳，使水质浑浊，影响池塘中藻类光合作用，减少水体中能量来源；沉降性能太好，则增加了系统的搅拌负荷，不利于絮体以及絮体中微生物的生长，所以沉降性能不佳或太好，均不利于养殖对象的生长。研究表明，生物絮体中总的EPS约占活性污泥总有机物质量的80%，是生物絮体的主要组成成分[4]，且对污泥沉降和絮凝性能具有重要影响，其主要由LB-EPS和TB-EPS两部分组成[5]。Liao等[6]通过对大量数据统计分析发现，大量 EPS会使絮体的沉降性能变差。研究表明，EPS的成分有多糖、蛋白质、氨基酸、核酸、脂类、糖醛酸和腐殖质等，且以多糖[7]和蛋白质[8]为主，两者总含量约占EPS总量的70%～80%[9]。研究表明，TB-EPS含量的增加可以促进生物絮凝，但当其含量超过60 mg/L，TB-EPS含量的增加对生物絮凝效果没有明显的影响[10]。王红武等[5]指出LB-EPS对污泥的沉降性能以及絮凝性能起着主导作用，当LB-EPS含量越多时，污泥沉降和絮凝性能越差。在前人的诸多研究中，因不同研究中EPS来源不同，同时忽略了EPS内外层性能以及提取方法的差异，所以使得大家的研究结果存在较大差异，且关于EPS对絮体沉降性能的影响没有定论。

本实验对生物絮凝-新吉富罗非鱼养殖系统启动阶段生物絮体EPS、营养成分以及沉降性变化作了初步研究，以期为生物絮凝技术的深入应用提供理论技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及运行工况

实验用新吉富罗非鱼取自上海海洋大学水产养殖研发平台，挑选体质健康，规格一致的个体进行实验，实验用鱼的平均体重为58.30 g。实验投喂饲料为膨化配合饲料，采购自漳州日高饲料有限公司。饲料的营养成分：水分10%，粗蛋白37.9%，粗纤维12.0%，粗灰分13.0%。实验用碳源为一水葡萄糖(分析纯)。

实验在上海海洋大学循环水养殖研发平台内进行。实验设置在3个养殖有效容积为1 m3的养殖缸内进行，用1 kW可控温加热棒控制养殖水体温度在25 ℃左右，每个养殖缸中投放9 192 g的新吉富罗非鱼。每日投喂饵料2次，按鱼体重3%的投喂量进行投喂。实验期间通过电磁式空气泵(ACO-008，138 W，浙江森森实业有限公司)向养殖缸内24 h无间断充气，使养殖水体中的溶氧维持在5 mg/L以上。以NaHCO3调节pH，控制pH值在7.0～8.5的范围内，添加葡萄糖作为碳源，其添加量按文献[5]中的公式：△CH=0.465x 饵料投喂量，即需要添加碳源量为投喂饲料质量的46.5%，同时调控碳氮比(C/N)维持在15以上；每3 d通过沉淀吸附过多的固体悬浮物来调节养殖缸内的总固体悬浮物(Total solid suspension,TSS)；每日观察并记录罗非鱼状况；实验周期为31 d。

1.2 水质指标的测定

1.3 絮体指标的测定

每3 d从养殖缸中收集一定量的絮体，经65 ℃干燥后，使用元素分析仪测定C、N 含量。生物絮体内含N量浓度=TSS (mg/L)·N(%)，污泥沉降指数(SVI)：衡量絮体沉降性能重要指标，指混合液沉降5 min或30 min相应的1 g干絮体所占的体积即为SVI。每3 d用英霍夫锥形管测定30 min后的絮体体积(FV-30 min)，以FV-30 min与MLSS之比计算絮体体积指数(SVI30)；粗蛋白含量采用杜马斯燃烧定氮法[13]；样品经过普通水解后在氨基酸自动分析仪(S-433D，SykamGmbh，德国)上测定氨基酸的含量。

1.4 EPS提取方法及测定

取40 mL混合液，4 000g离心5 min，倒去上清液，取固体加入20 mL纯水用漩涡振荡器重悬浮1 min得到固体，将混合液用6 000g离心，得到上清液，经0.45 μm滤膜过滤所得滤液即为松散附着的胞外聚合物(LB-EPS)。将剩余固体用20 mL超纯水重悬浮，得到混合液放置在冰水浴中用细胞破碎仪(SCIENTZ-ⅡD，宁波新芝，中国)400 W超声波10 min，10 000g离心，上清液经0.45 μm滤膜过滤后所得滤液即为紧密粘附的胞外聚合物(TB-EPS)。EPS 中的多糖 (PS) 含量采用硫酸-蒽酮法测量 (标准物质为葡萄糖) ；蛋白质含量 (PN) 采用修正的Folin-酚法测量 (标准物质为牛血清蛋白 )；DNA含量采用二苯胺法进行测量(标准物质为2-脱氧-D-核糖)[14,15]，总有机碳(Total organic carbon,TOC)利用总有机碳分析仪测定(MultiN/C 2100，耶拿，德国),腐殖酸含量用修正的Folin-酚法测量。研究表明，生物絮体中总EPS的质量大概占活性污泥总有机物质量的80%左右，所以在生物絮体中EPS是其主要组成成分，故EPS的总量可以用TOC表示[15-17]。

2 结果与讨论

2.1 养殖缸中水质变化

图1 养殖缸中水质的变化(平均值±标准差)

2.2 絮体沉降性

本实验中，如图2(a)所示，在反应建立的前15 d，SVI30先升高，之后出现下降。说明生物絮体在形成过程中，SVI30先升高后降低，其沉降性能先降低后升高。结合图4和图5分析原因是：在实验的前期，生物絮体中的LB-EPS含量较多，而在LB-EPS中以多糖为主，随着反应的进行，LB-EPS的含量下降，TB-EPS的含量上升，导致LB-EPS占总EPS含量的百分数下降，使得TB-EPS发挥了主导作用，且在TB-EPS中以蛋白质为主。据报道[16]，对于不膨胀的污泥，SVI值直接与Zeta电位(或葡聚酸含量)成正比，即胞外多糖物质增加，污泥SVI值增加，沉降性能降低；另外LB-EPS位于絮体的外部，主要以离子键和氢键结合在一起，具有较高的表面负电荷与较强的结合水能力，使絮体外层具有较大静电斥力与空间位阻，使得絮体的沉降性能变差[5,10,16]。所以污泥的沉降性能出现先降低后升高的现象。同时结合图4和图5知，在本实验的整个实验过程中SVI30的变化趋势与LB-EPS中多糖的变化趋势相似，而LB-EPS中以多糖为主，所以当LB-EPS发生变化时，SVI30也发生变化；到实验后期LB-EPS在EPS的主导作用被TB-EPS逐渐取代，使得SVI30上升，絮体沉降性变好。同样王红武等[5]的实验结果表明，LB-EPS含量与SVI两者之间的关系成线性正相关，LB-EPS含量的降低，导致SVI下降，而SVI基本不受TB-EPS的影响，这与本实验结果相似。而在马兴冠等[21]的研究表明，EPS总量、蛋白质及多糖与SVI的多项式非线性回归方程均表现为正相关性，多糖、蛋白质含量增加，SVI 整体上均呈逐渐增大的趋势，本实验结果与其相比，存在一定出入，分析原因是其将胞外聚合物(EPS)当作整体来研究，没有将其分为LB-EPS和TB-EPS两部分分析。

有研究指出，在生物絮体中TB-EPS含量远比LB-EPS高，且相较LB-EPS而言，TB-EPS对絮凝性影响更大[14]，因此生物絮体形成的关键是TB-EPS。TB-EPS在内层，通过疏水结合部位结合在一起，且TB-EPS含有较少的带电官能团或极性基团，通过氢键或趋向力结合的水分子数目较少，大分子之间或大分子与细菌细胞之间的结合更加紧凑。另外，随着污泥龄的增大，TB-EPS疏水性增大，所结合的水分子减少，导致絮体内部结构密实从而促进活性污泥沉降[5,10,22-23]。实验过程中，SVI30在27.66 mL/g到74.96 mL/g范围内，絮体未发生膨胀处于正常范围。由图2(b)知，随着絮体的发展VSS不断增加，说明絮体中生物量也在不断的增加，生物絮凝系统启动效果良好。

图2 絮体的SVI30 (a)和VSS (b)变化(平均值±标准差)

2.3 生物絮体营养成分的变化

图3是絮体中总氨基酸和粗蛋白含量的变化，从图中可以看出随着反应的进行，絮体中粗蛋白和总氨基酸的含量不断增加，在第31天时，粗蛋白含量为37.55%与饲料中37.87%接近。在Grab[19]和Luo[19]等的研究中发现，絮体中粗蛋白的含量可以达到26.35%～28%，本实验研究结果发现絮体中粗蛋白的含量相对较高。分析其原因，可能是由于在投饵过程中所投饵料过剩，导致系统中残饵量较多所引起的。

图3 絮体中粗蛋白和总氨基酸变化 (平均值±标准差)

2.4 EPS的变化

本实验中絮体形成阶段EPS变化如图4和图5。在经过31 d的反应后， TOC的总量呈下降趋势，说明反应系统中EPS的含量在下降。由图4(a)所示，在实验初期LB-EPS中的蛋白质、腐殖酸、多糖和DNA等成分的含量在不同时期出现增长，基本从实验第15天开始，均呈下降趋势，从图4(b)可以看出，在整个实验过程中LB-EPS的总含量呈下降趋势。由图5(a)可知，在实验的前15 d，TB-EPS中的蛋白质、腐殖酸、多糖和DNA等成分的含量均呈现上升趋势，之后出现下降。对应图5(b)，在实验的前15 d，TB-EPS的含量呈现上升趋势，15 d之后直到实验结束，TB-EPS的含量均在下降。即在生物絮体形成阶段LB-EPS的含量呈下降趋势，而TB-EPS的含量呈现先升高后下降的变化趋势。另外，由图4(a)和图5(a)分别可以看出，LB-EPS的成分以多糖为主，而TB-EPS的主要成分则是蛋白质。

EPS是微生物为了适应环境而分泌的高分子有机化合物，可将细菌、颗粒碎屑连接形成菌胶团[5,16]。Liu等[20,23-24]人的研究指出，水体中磷元素的增加会抑制EPS的产生。结合图1(b)可知在整个实验过程中，由于养殖系统中固体废弃物的不断积累，降解和分解，使得反应系统中总磷的含量一直增加，在一定程度上抑制了EPS的产生。研究表明，随着污泥龄的增加，LB-EPS的含量被细菌作为碳源和能源物质不断降解[25]，导致其含量下降。另外，开始时养殖缸内细菌呈对数增长，因此TB-EPS含量不断增加，但在之后适应了环境，从而TB-EPS含量开始降低。本实验均与前人研究结果相一致。

图4 LB-EPS含量变化(平均值±标准差)

图5 TB-EPS含量变化(平均值±标准差)

3 结论

原位式生物絮凝养殖新吉富罗非鱼的启动阶段，控制养殖水体中溶氧5 mg/L，水温25 ℃时，由于碳源的添加不足，养殖缸内硝态氮发生积累，由初始的3.85 mg/L增加到了第31天的77.08 mg/L。且整个实验过程中，PO43--P一直在积累，从第21天开始下降并维持在一个相对稳定的状态，而总磷的质量浓度一直处于增长的状态。

在絮体形成过程中，SVI30先升高后降低，说明沉降性能先降低后升高。生物絮体的SVI30受LB-EPS影响较大，而TB-EPS的含量对生物絮体的SVI30没有显著的影响；即生物絮体的沉降性能先变差之后变好；且絮体中的生物量不断增加。

随着反应的进行，絮体中粗蛋白和总氨基酸的含量不断增加，在第31天时粗蛋白含量达到37.55%，与饲料中37.87%相接近。总氨基酸的含量一直保持着增长的趋势，其变化趋势基本与粗蛋白变化趋势相似。

本实验中，絮体形成阶段EPS的含量总体呈下降趋势；且EPS主要由LB-EPS和TB-EPS组成；而LB-EPS中其成分以多糖为主，且随着絮体的发展LB-EPS呈下降趋势；而TB-EPS的主要成分是蛋白质，其变化是随着絮体的发展TB-TPS先升高后降低。

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