饲料中维生素A测定的前处理条件研究

刘彩丽

(普研(上海)标准技术服务股份有限公司,上海 201600)

维生素是饲料中的重要组成部分，《饲料添加品种目录》列出的维生素有32种，分为2类：一类是脂溶性维生素，包括VA、VD3、VE和VK3，另一类是水溶性维生素，包括B族维生素和VC。维生素A是视紫红质(感光色素)的重要组成成分，维持正常视觉功能；可保护上皮组织，防止上皮细胞萎缩、角化，保护呼吸道、消化道、生殖泌尿器官黏膜，利于公畜精子生成；增强动物免疫力，促进骨骼发育[1]。但准确测定饲料中VA的难度较大，主要原因是VA以微胶囊形式加入预混剂中，然后与饲料进行干混，均匀度难以保证。VA微胶囊的粒径比其他维生素微胶囊的粒径大，壁材为明胶，而饲料的载体为米糠、石粉，VA颗粒在饲料中流动很好。VA的提取方法有皂化、超声、酶解超声等多种方法。

虽然维生素A是一种必须摄入的脂溶性维生素，是维持机体正常代谢的重要营养素，但维生素A摄入过多同样会引起胚胎吸收、流产、出生缺陷等[2]。只有准确掌握其正常需求量，才能真正发挥它的营养作用，因此准确测定饲料中VA的含量至关重要。

通过正交实验研究饲料中维生素A测定的最佳前处理条件，为准确测定VA提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

Maxatase 酶制剂/ SAVINASE 6.0 TK / 2709碱性蛋白酶，异丙醇(色谱纯)，焦性没食子酸，L-抗坏血酸乙醇溶液, 氢氧化钾，无水乙醚，无水乙醇，甲醇(色谱纯)，正已烷(色谱纯)，环已烷(色谱纯)、伊利奶牛育成期精补料(标准规定值由饲料供应方提供)。

1.2 实验仪器

DS-8510DTH生析超声仪：上海生析超声仪器有限公司；EYELA旋转蒸发器：东京理化器械株式会社；ANPEL氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司；密理博纯水仪：密理博中国有限公司；梅特勒分析天平：梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司；Agilent 1260高压液相色谱仪(DAD 检测器)：安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正交实验设计

因为VA在饲料中的均匀度、流动性和不同测定方法都会影响测定结果，对前处理的3个主要因素：称样量，制样方式，提取方法进行了分析，设计了3因素3水平的正交实验，L9(33)正交实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平

1.3.2 提取方法[3]

1.3.2.1 皂化提取 按GB/T 17817—2010第一法进行操作。

1.3.2.2 酶解超声提取 按GB/T 7292—1999进行操作。

1.3.2.3 酶解皂化提取 对上述2个方法进行组合操作。

1.3.3 定量测定方法

仪器条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18，250 mm×4.6 mm，5μm；流动相∶V(甲醇)∶V(水)=98∶2；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；波长：325 nm。

分别注入20 μL的工作溶液及样品提取溶液于液相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积。根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。

依据试样溶液测定的响应峰面积或峰高，在标准曲线上查出(或用回归方程计算出)试样溶液的浓度C。

样品中维生素A的含量：X=C×V/m

式中：X为样品含量， mg/kg；V为定容体积，mL；m为称样量，g 。

维生素A的分子量为286.45，维生素A乙酸酯的分子量为328.49，维生素A乙酸酯与维生素A的换算系数为1.15。

维生素A的色谱图如图1。

图1 维生素A的色谱图

1.3.4 评分方法

根据GB/T 17817—2010饲料中维生素A的测定的重复性要求和GB/T18823—2010 饲料检测结果判断的允许误差，以2次平行测定所得结果的相对偏差(RPD)及测定值与标准规定值(饲料供应商的添加量)的相对误差(δ)进行打分，评分原则见表2。

表2 评分原则

注：对于评分可以根据实际情况取非整数的数值。

2 结果与分析

按照L9(33)正交实验因素水平表，每组数据进行了2次平行测定实验，正交试验结果及各组实验结果的评分见表3。

表3 正交试验结果及各组实验结果的评分

根据各组实验的评分结果，进行了方差分析，结果见表4。

表4 各组数据的方差分析

从表4的极差R值可以看出各因素对测定结果影响的主次顺序是： A>B>C ，即样品状态对测定结果影响最大，其次为称样量，最后为提取方法。最佳前处理方案为A3B3C1即：原样、称10 g、皂化。

3 小结

在饲料中维生素A测定过程，样品状态对测定结果影响最大，其次为称样量。最佳的前处理方案为样品不进行振荡、不进行打样、使用原样进行测定，称样量为10 g，用皂化方法进行提取。

皂化提取方法对数据的影响较小，选择酶解超声提取方法可提高提取效果。

建议饲料样品的送检时，要确保样品用容器装满并压实，以防止运输过程中样品在容器中来回振荡引起VA微胶囊颗粒流动。

[1]谈暠媛，鲁小翠. 饲料中维生素 A 的测定方法解析[J].湖北畜牧兽医.2014，35(12)：62-63.

[2]方桂红，程莉.维生素A的生理功能及毒性研究进展[J]. 轻工科技. 2012(8)：10-11.

[3]邓国东，王亚吨，毛乾慧. 饲料中维生素 A 分析方法研究进展[J].中国饲料.2016(12)：32-34.●

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