基于Cytb基因多态性研究西藏地区8个藏山羊群体遗传结构及母系起源

邓 娟，张红平，巴 贵，次仁德吉，宋天增*，李 利*

(1.四川农业大学动物遗传育种研究所，成都 611130； 2.西藏农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850009)

藏山羊作为我国独特的种质资源，其体型矮小，被毛富有光泽，颜色较杂，除白色和黑色较多外，还有青色、褐色等，在青藏高原的农业、经济和文化，甚至宗教等方面都扮演了重要角色[1]，品种主要分布在西藏自治区全境、四川省甘孜和阿坝2个自治州、青海省玉树和果洛藏族自治州、甘肃甘南藏族自治州及新疆部分地区[2]。高原环境的长期阻隔以及地理分布的差异，在长期的自然选择和人工选择下，藏山羊群体间缺乏足够的基因交流，逐步形成了不同的生态类群。王杰等[3]、王永等[1]先后采用SSR与ISSR分子标记对藏山羊的遗传多态性进行了分析，结果显示，藏山羊多样性较丰富，但群体间存在差异。在此次采样过程中，笔者发现当地牧民大多以单户养殖为主，一些产区(如城关镇、林周县、萨嘎县等)的藏山羊群体数量已经极其稀少。加上近年来，在经济利益的驱动下，各地也持续引入外来山羊品种，如辽宁绒山羊[4]、南江黄羊[5-6]、内蒙古白绒山羊[7]等对本地山羊品种进行遗传改良，提高其综合生产性能，导致藏山羊这一遗传资源正在面临危机。

线粒体基因组(Mitochondrial DNA，mtDNA)上的细胞色素b(Cytb)是蛋白编码基因之一，其进化速度适中，序列片段包含种内到种间的进化遗传信息，已被用来研究多个物种的系统发育关系和遗传多样性[8-9]。然而，利用Cytb基因对藏山羊的遗传多样性和分子进化方面的研究还未见报道。本研究对西藏地区8个群体共157个藏山羊个体的Cytb基因全序列进行扩增和测序，在此基础上分析群体遗传多样性，揭示不同地域藏山羊群体间的遗传结构及系统发育关系，为藏山羊品种资源的保护与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

根据藏山羊的主产地区，从西藏8个地区采集藏山羊血液样本共计157个，每个群体内的个体之间无亲缘关系。采用颈静脉采血，3.9% ACD抗凝，-20 ℃冰箱储存备用。样本详细信息见表1。

表1藏山羊样品采集信息

Table1SampleinformationofTibetangoats

群体Population海拔高度/mAltitude地理位置Location样本数/头Samplesize黑竹林藏山羊HZL5492西藏自治区拉萨市黑竹林30城关藏山羊CG3650西藏自治区昌都市卡若区城关镇7当雄藏山羊DX4200西藏自治区拉萨市当雄县40吉隆藏山羊JL4000西藏自治区日喀则市吉隆县15拉萨藏山羊LS3658西藏自治区拉萨市9林周藏山羊LZ4200西藏自治区拉萨市林周县9曲水藏山羊QS4200西藏自治区拉萨市曲水县39萨嘎藏山羊SG4600西藏自治区日喀则市萨嘎县8合计Total——157

1.2 试验方法

1.2.1 序列扩增及测序 采用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit；北京)提取藏山羊血液基因组DNA。扩增Cytb全序列所用引物参照藏山羊mtDNA全序列(GenBank No.：KJ940969)设计(正向引物F1： 5′-AATAGGCGAAGGTTTTGAA-3′，反向引物R1：5′-GCTTTGGGTGCTGATAGTG-3′)，并由成都擎科生物公司合成。本研究中，PCR为30 μL反应体系：10×缓冲液15 μL，DNA(2.5 ng·μL-1)1 μL，正反向引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，超纯水12 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 预变性5 min，35个循环(95 ℃ 30 s，55.3 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，72 ℃ 延伸10 min，之后于4 ℃保存。PCR产物在1.5% 的琼脂糖凝胶电泳及核酸检测仪上检测纯度及浓度后，送至成都擎科生物有限公司进行测序。为确保序列的准确性，每条序列均经过正反双向测定。

1.2.2 数据处理及分析 所有测得并经拼接的DNA序列用DNASTAR软件中的SeqMan 5.01(DNAstar Inc；Madison. WI)程序排列同源序列，并进行人工校正。用DnaSP 5.0软件[10]统计单倍型种类，计算核苷酸多样度(Nucleotide diversity,Pi)和单倍型多样性(Haplotypic diversity,Hd)。用MEGA 4.0 软件[11]计算变异位点、简约信息位点、遗传距离等，构建系统发育邻接树(Neighbor-Joining，NJ)，以Bootstrap 1 000次重复抽样检验分支置信度[12]。利用Network 4.6.1.0软件[13]构建单倍型网络图，以直观揭示单倍型之间的亲缘关系以及基因流。Arlequin 3.5 软件[14]计算群体间遗传分化指数(FST)，并根据Nm≈(1-FST)/(2FST)计算群体间的基因流值；将种群进行群体划分模式检测，用分子变异分析方法(AMOVA)估测遗传变异在种群内和种群间的分布、分化指数和对应的P值。

2 结 果

2.1 藏山羊的Cytb序列特征及遗传多样性

序列扩增及测序后经软件比对并人工校正后得到157条全长1 140 bp的Cytb基因序列(图略)，共检测到33个变异位点，包含21个简约信息位点和12个单碱基替换，其中错义突变9个，无义突变24个，所有序列没有出现插入或缺失的变异位点。基于此定义了30种单倍型(H1～H30)，其中CG(H1、H2)与 LS(H15、H16)为群体独享单倍型。遗传多样性结果表明(表2)，LZ(Hd=0.722±0.097，Pi=0.001 8±0.000 6)与CG(Hd=0.625±0.093，Pi=0.001 8±0.000 4)的多样性指数接近，且高于其他群体；JL多样性指数(Hd=0.133±0.112，Pi=0.000 4±0.000 3)在8个群体中最低。但总的Hd(0.736±0.035)和Pi(0.001 8±0.000 2)值显示出较高水平，表明所研究西藏地区的8个藏山羊群体具有较丰富的遗传多样性。

表2藏山羊群体间遗传多样性指数及中性检验值

Table2GeneticdiversityandneutralitytestsamongTibetangoatpopulations

群体Population单倍型种类及分布Haplotypesanddistribution单倍型多样性(Hd)Haplotypediversity核苷酸多样度(Pi)Nucleotidediversity中性检验NeutralitytestTaijima’sDFu’sFsCG7(H3、H8-H13)0.625±0.0930.0018±0.0004-0.828-0.353*DX2(H1、H2)0.476±0.1710.0004±0.00020.5590.589*HZL5(H3-H7)0.315±0.0910.0007±0.0002-1.111-0.851*JL2(H3、H13)0.133±0.1120.0004±0.0003-1.6850.834*LS2(H15、H16)0.222±0.1660.0008±0.0006-1.6101.844*LZ3(H3、H13、H17)0.722±0.0970.0018±0.00060.4971.855QS14(H3、H10、H11、H18-H28)0.682±0.0840.0017±0.0003-1.460-7.246**SG3(H3、H29、H30)0.464±0.2000.0010±0.0006-1.0300.506*合计Total30(H1-H30)0.736±0.0350.0018±0.0002-1.900*-22.020**

*. 0.01

2.2 藏山羊群体遗传分化与基因交流

群体间遗传分化指数(PairwiseFST)结果显示(表3，下三角)，78.6 % 群体间的FST值达到了显著水平(P<0.05)，表明大部分群体间(22/28，78.6%)发生了显著或极显著的遗传分化。其中CG与LS间差异最大(FST=0.883 0，P<0.01)，表明两组群体间的遗传分化程度最高；反之DX和SG群体间分化程度最低(FST=0.032 9，P>0.05)。基因流参数值(Nm)区间为0.066 3～14.697 6(表3，上三角)，表明各群体之间的基因交流水平差异较大，其中CG、LS与其他群体间的基因交流受阻(Nm< 1)，表明群体间高度分离；SG和DX间基因交流较多(Nm>1)，群体分化程度低，与遗传分化指数分析结果相符。AMOVA分析结果(FSC=0.392，P<0.001，表4 )表明，组内群体间遗传分化差异极显著，但变异来源所占比例较低，变异主要发生在种群内部，提示群体遗传结构差异在缩小。整体群体间基因流Nm=0.776<1，表明藏山羊整体基因流水平较低，存在一定的遗传分化。

表3藏山羊群体间的遗传分化指数FST(下三角)和基因流值Nm(上三角)

Table3ThepairwiseFST(belowthediagonal)andgeneflowNm(abovethediagonal)amongtheTibetangoatpopulations

群体PopulationCGDXHZLJLLSLZQSSGCG0.12670.29570.07250.06630.27050.26420.1388DX0.7978**5.224812.06280.17572.23031.824714.6976HZL0.6284**0.0873**7.39390.38275.05313.721511.8548JL0.8734**0.03980.06330.12322.65841.59255.5416LS0.8830**0.7400**0.5665**0.8023**0.34520.31630.2159LZ0.6489**0.1831**0.0900*0.1583**0.5916**2.91534.8967QS0.6543**0.2151**0.1184**0.2390**0.6125**0.1464**2.7146SG0.7827**0.03290.04050.08280.6984**0.09270.1555**

表4藏山羊群体分子变异方差分析

Table4Analysisofmolecularvariance(AMOVA)ofTibetangoatpopulations

变异来源1Sourceofvariation1自由度df平方和Sumofsquares变异组成Variancecomponent变异比例/%Percentageofvariation分化指数2DifferentiationindexP值Pvalue组内Withingroup332.8300.11910.480.1050.175组内群体间Amongpopulationswithingroup424.9690.32628.720.321<0.001群体内Withinpopulation149102.7480.69060.800.392<0.001合计Total156160.5481.134

1.分组依据：来自同一个市区的样本被分在同组。2.组内分化指数为FCT；组内群体间分化指数为FSC；群体间分化指数为FST

1. The samples from the same city are divided into one group.2.FCT,FSCandFSTrepresent differentiation indexes within group, among populations within group and within population, respectively

2.3 藏山羊的群体遗传关系与系统发育

图1是基于群体间遗传距离构建的群体间NJ树，结果显示，DX与SG首先聚在一起，之后依次与HZL、QS、JL、LS、LZ、CG聚类。总体上看，CG与LS的遗传关系最远，DX与JL遗传关系最近。另外，将NCBI下载的山羊Cytb4个单倍型组(Haplogroup A-D，登录号：KP059202、KP059212、KP059220和KP059225)作为参考序列，构建了30种单倍型系统发育NJ树(图2)，藏山羊单倍型聚为4个支系，呈现出较强的谱系结构，不同地理来源的个体没有完全形成各自的分支，而是混杂分布部分交错，没有形成明显的地理分隔格局。其中，Haplogroup A 是主要单倍型组，由8个群体单倍型组成，其中LS、CG和JL的单倍型只在A系；Haplogroup B构成最简单，只有1种单倍型(H17)；Haplogroup C 由来自QS和HZL的部分单倍型组成；Haplogroup D由HZL、QS、SG和DX的部分单倍型组成。

图1 基于藏山羊群体间遗传距离构建的亲缘关系NJ树Fig.1 An neighbor-joining (NJ) tree based on genetic distance of the Tibetan goat populations

图2 藏山羊单倍型系统发育NJ树Fig.2 An neighbor-joining (NJ) tree based on Tibetan goat haplotypes

2.4 藏山羊单倍型网络关系

根据30种单倍型序列数据及其出现的频率，绘制出藏山羊群体单倍型的中介网络图。图3显示，以H3为中心，呈星状向周围单倍型发散，表明群体可能发生过群体扩张；其次，H3与H18和H13连接，逐渐形成大大小小的网络分支，推断H3是主导单倍型，主要形成H3-H18和H3-H13的2个不重叠分布区的历史基因流，通过扩散或基因交流，衍生出其余单倍型，分布于不同群体中；其中QS经过基因流的扩散，分布最广。部分来自不同地区的群体的个体分享同种单倍型，但地理位置相同或相近的个体不完全聚类到同一个分支，表现了藏山羊群体地理关联性较弱。

图3 藏山羊单倍型中介网络图Fig.3 Network analysis of Tibetan goat haplotypes

2.5 中性检验与种群动态分析

中性检验值分析显示(表2)，从单个地理群体看，JL、SG、LS的Tajima’sD和Fu’sFs值为一正一负，说明3个群体符合中性假说，没有发生过群体扩张事件。DX、LZ 的2个值均为正，提示在历史发展中，群体数量有过缩减；CG、HZL、QS的2个值均为负数，表明群体数量可能发生过急速扩增。从整体藏山羊种群来看，其中性检验结果均为负值(Tajima’sD=-1.900，P<0.05；Fu’sFs=-22.020，P<0.01)，且错配分布曲线显示为多峰现象(图4)，表明藏山羊在历史驯养过程中，可能因为部分种群的急速扩增而导致整体有种群扩增的迹象，曲线的多峰现象同时也验证了部分群体数量的缩减事件。

3 讨 论

3.1 藏山羊遗传资源的保护

普遍认为，遗传多样性的高低反映了群体的环境适应能力和进化潜能[15]。本研究中，157只藏山羊共有30种单倍型，整体单倍型多样性显示出较高水平(0.736)，表明整个藏山羊群体较丰富的遗传多样性。但各群体的单倍型多样性水平参差不齐，低至0.133，高达0.722，核苷酸多样度均为较低水平，表明群体间多样性水平差异较大，然而最高多样性参数值(林周藏山羊群体LZ)低于中国家养山羊地方品种的平均水平[16-17]。此外，中性检验结果和错配分析证明，在藏山羊历史驯养过程中经历过群体扩张事件，表明群体遗传变异得到了积累，整体表现出较高的多样性。然而值得注意的是，如果一个群体长期处于低水平的变异率或遗传多样性的状态下，这将成为一个重要的濒危信号[18]。吉隆县位于西藏自治区西南部，是西藏同纬度地带自然条件比较独特的地区之一，自然生态环境结构复杂，交通相对闭塞，这些因素可能导致吉隆藏山羊群体(JL)与外部群体基因交流受限，有效群体数量逐渐缩小，处于多样性快速丢失的过程中。因此，保护藏山羊群体的遗传多样性已刻不容缓。

图4 基于Cytb基因分析藏山羊群体的错配分布曲线Fig.4 Mismatch distribution curves of the Tibetan goats based on Cytb sequences

3.2 藏山羊群体的遗传结构

FST值的大小反映了给定群体间的遗传分化水平，0～0.05表示轻度分化，0.05～0.25表示中度分化，大于0.25表示重度分化。本研究中，8个群体间遗传结构大部分有了明显分化，但分化程度有所不同。AMOVA结果显示了群体间极显著的变异程度，但变异来源所占的比例较低，提示群体间的遗传结构差异正在缩小。Nm值大小表明一个群体向另一个群体的基因流动，城关群体(CG)与拉萨群体(LS)的单倍型种类完全独立，不与其他群体共享，且基因流值均小于1，表明城关地区和拉萨地区的藏山羊群体分离程度最高。这与我们之前基于mtDNA D-loop 序列所研究的藏山羊遗传结构结果是相符的[19]。产生此结果的一个重要原因可能是，所研究群体的有效群体数量较低(如LZ、SG、CG等)，且生活在封闭的高山环境中，导致当地藏山羊与邻近藏山羊群体之间的基因交流受限，进而长期保持低水平种群规模。由于有效群体数量的衰退，核苷酸替换数也极大可能被固定[20-21]。近年来，随着山羊养殖业的迅速发展，牧民为了短期效益，盲目地引入外来品种与藏山羊进行无序杂交，进一步导致藏山羊优良基因逐渐丢失，多样性降低，遗传结构差异缩小，地理分隔格局变弱。结合J.C.Avise等[22]提出的亲缘地理格局的模式分析藏山羊8个群体的遗传结构，LS和CG符合“岛屿模型”，出现独享单倍型；QS、DX、HZL、LZ、JL和SG地理屏障作用较小，使群体未彼此隔开，个体发生过相互迁移，有较多的基因交流。其中，当雄县位于西藏自治区中部，为拉萨市的纯牧业县，加上现代畜牧科技(如人工授精技术)的利用与推广，使得当雄产区的藏山羊与外群基因交流更为充分，群体间遗传分化变弱。

3.3 藏山羊群体的多个母系起源

西藏卡若遗址出土的野生动物骨骼里发现了藏原羊的骨骼[23]，说明藏族先民驯养家羊的历史可追溯至4 000年前的新石器时期。迄今为止，关于藏山羊起源的观点并不一致。在以往的研究中，B. Fan等[24]分析了13个中国山羊品种的mtDNA D-loop序列多样性，王杰等[3]利用微卫星标记分析了藏山羊群体系统发育关系，其结果均表明，藏山羊可能有多个母系起源；此外，蔡欣等[25]得到了不一致的结果，提出了藏山羊单个起源的观点，可能是由于样本采集地点、数目差异等因素导致。目前，对家养山羊的起源研究大部分是通过对mtDNA的研究将山羊大致分为了以下几个单倍型组：Haplogroup A、B、C[26]、D[27]、F[28]和G[29]。M.B.Joshi等[30]命名了一个新的单倍型组(Haplogroup E)，但在加大样本量研究后，Haplogroup E被认为是A的附系[31]，现今我国家养山羊共发现了4个支系[32]，在本研究中也证实了这点。本研究加入NCBI下载的4种Cytb单倍型作为参考序列构建藏山羊30个单倍型系统发育树，形成4个主要的单倍型组(Haplogroup A-D)，其中Haplogroup A为主要单倍型组，Haplogroup B只由LZ一种单倍型构成，结果提示，藏山羊有4个母系起源，这与已发表的藏山羊起源研究的结果是一致的[19]，进一步支撑了藏山羊多个起源的假说。Haplogroup A广泛分布于全世界家养山羊品种中，有报道称Haplogroup B起源于中国[33]，Haplogroup C现在主要分布在欧洲地区，K.Nomura等[34]研究表明，Haplogroup D主要分布在亚洲南部和中部地区。本研究结果表明，藏山羊可能起源于欧亚大陆，有4个母系起源。此外，藏山羊个体没有完全依据采样区域形成独立分支，而是呈现出地理上的融合，这一点在Haplogroup A中有明显体现，8个群体中均有单倍型出现在Haplogroup A，Haplogroup C和D也有部分区域混合。Haplogroup B的构成单倍型最少，可能是因为样本数不够，需要更多的样本支持。网络图中心单倍型H3的主要群体有DX和HZL，表明这2个群体古老单倍型保留得最多，分布最广。此外，曲水地区的藏山羊群体传播范围广，在进化上处于更近的时期。这样的分布现况可能是多个母系祖先的影响、世代重叠、不同地理位置的群体混合，以及伴随着基因漂变、自然选择等原因导致[35]。

4 结 论

本研究表明，8个藏山羊群体总的遗传多样性水平较高，但群体间的遗传多样性水平不一，差距较大。各群体间大部分发生了明显的遗传分化，但没有形成明显的地理分隔格局；8个藏山羊群体分成了A、B、C、D 4个单倍型组，提示藏山羊有4个母系起源。

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