超声波检测母牛卵巢后同步排卵的研究

编译/伍佰鑫 雷 虹 张翠永 李剑波 宗占伟 易康乐

（湖南省畜牧兽医研究所）

牛只的不孕会给养殖者造成严重的经济损失，引起母牛不育的原因比较复杂，主要包括七大类：先天性不育、营养性不育、管理不当引起的不育、繁殖技术性不育、母牛衰老性不育、疾病性不育和免疫性不育。同期发情又称同步发情（排卵），就是利用某些激素制剂人为控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情（排卵），以便集中配种；同期发情（同期排卵）可解决牛群过于分散引起的人工授精不便等问题。超声波是机械的压力波，以人耳能听到的声波频率为基准，其频率高于20 000 Hz；超声波的频率可高达1.0×1011Hz，测定频率范围一般在1～6 MHz，高频显示清楚但范围较窄，低频的清晰度中等但范围较宽；超声波的传播要依靠弹性介质，原理是将很短的电脉冲转变为超声波脉冲，传送到测定的介质之中，脉冲遇到不同的组织层时，产生不同程度的声衰减，返回至探头，再转变为电脉冲（回声信号）呈现在屏幕上，根据传送时间与回收时间的间隔，计算不同组织的厚度或长度。在近20 年的时间里，超声检查设备的功能及质量得到快速提升，设备的体积越来越小，携带越来越方便，使用越来越简单。

有些母牛发情症状不明显，但体内却呈现正常的发情周期，容易被人忽视。对有黄体的母牛诱导发情的方法之一是，仅用PGF（前列腺素F2α）处理后就进行人工输精，发情症状需要仔细观察，因为依赖于卵泡大小的发情时间变化很大，容易漏配。另外，（用手）直肠触诊到的黄体大小不准确，不一定具备分泌卵泡的功能，也就不能诱导发情。PGF处理后，母牛可能呈现发情症状（例如爬跨），但难以把握适宜的输精时间，导致受孕率低。同步排卵和定时输精是解决母牛繁殖问题的重要方法。而运用便携式超声波扫描仪评估母牛黄体及卵泡状况，比直肠触诊法的判断更加科学和准确，对人工智能时代的奶牛和肉牛养殖者有重大的启发和参考价值。

1 研究方法

从8 个不同地点牛场的1 272 头母牛中随机选择578 头母牛[年龄（5.5±3.1）岁；产犊后（84.0±48.3）天；胎次（4.3±3.0）胎；体况评分（3.15±0.40）分；超声波检查卵巢黄体直径不小于18 mm；自由散养、自由饮水、1 天饲喂2 次干草和精饲料]。其中134 头母牛作为A试验组，注射前列腺素F2α（简称PGF）56 h之后，再注射促性腺释放激素（简称GnRH），16～20 h之后进行定时人工输精。另外138头母牛作为对照-1组，（仅只）注射PGF之后，根据母牛发情状况再输精（每天观察2 次；上午发情，下午输；下午发情，次日上午输）。由于A试验组和对照-1组的母牛饲养在一起，都在固定时间输精，很可能会有一些输精的母牛纳入对照-1组统计分析而引起误差，因此，还在其中的5 个牛场单独选择306 头母牛作为对照-2组，这个组的母牛既不检测卵巢黄体也不考虑排卵情况。在PGF处理时，A试验组和对照-1组母牛，使用肝素排空的采血管（日本），在母牛尾骨中部的静脉采集血样（10 mL/头）；对照-2组母牛不采集血样。血浆通过离心分离、-30 ℃保存直至激素水平分析结束。运用小型视频数字分析系统（mini-VIDAS）自动荧光免疫检验法（法国），酶联荧光分析血浆孕酮浓度。

当超声波检测到A试验组母牛卵巢黄体直径达到或超过18 mm时，给母牛肌肉注射PGF（0.5 mg氯前列烯醇，日本）；56 h后再肌肉注射GnRH（100 μg醋酸发酵素，一种垂体激素释放兴奋药，日本）；注射之后16～20 h之内，进行定时人工输精。输精24 h之后检测其中的74 头母牛以确认排卵。对照-1组母牛注射PGF（未注射GnRH）之后的96～100 h之内，其中72 头无论是否发情或人工输精，都检测排卵情况，以便比较A试验组母牛的同步排卵。排卵的定义是GnRH处理2 天内（或PGF处理后的96～100 h）卵巢中的大卵泡消失。

母牛激素处理后，6 台便携式超声波扫描仪用于检测卵泡参数（最大黄体和最大卵泡的直径）、排卵状况、输精后30～50 天的妊娠诊断。所有超声波扫描仪带有7.5 MHz线性探头，每2 台超声波扫描仪之间没有测量误差。卵泡直径按2 mm间隔分类。

另外从上述8 个牛场中的4 个牛场随机选择38 头母牛[年龄（6.7±3.4）岁；产犊后（73.3±39.2）天；胎次（4.9±3.1）胎；体况评分（2.9±0.3）分；超声波检查卵巢黄体直径不小于18 mm、自由散养、自由饮水、1 天饲喂2 次干草和精饲料]作为B试验组，按A试验组操作步骤，先注射PGF；56 h后再注射GnRH；完后16～20 h之内，进行定时人工输精。运用带有10.0 MHz线性探头的超声波扫描仪，通过直肠检测生殖道，视频记录卵巢结构（例如卵泡和黄体直径、PGF处理时的黄体体积、GnRH处理时的黄体体积）。在实验室播放视频，运用动态图像软件（美国）对卵巢进行形态学分析，例如卵泡和黄体直径、黄体体积（V）。在黄体两面最外侧，测量黄体的最大长度（L）和横向直径（TD），按修正椭圆体形状并根据下列等式估计黄体体积：V=0.523×L×TD× TD。

2 研究结果

黄体直径不小于18 mm的母牛（272 头），绝大多数[269头；98.9%（269/272）]的孕酮浓度不小于1.0 ng/mL。PGF处理时，A试验组和对照-1组的孕酮浓度分别是（8.34 ±4.21）ng/mL和（7.34±4.20）ng/mL，两个组无显著差异。A试验组PGF处理时，卵泡最大直径的大小（2 mm间隔）对受精率无显著影响。GnRH处理时，A试验组92%（124/134）的母牛、对照-1组87.7%（121/138）的母牛，最大卵泡直径不小于9.0 mm；两个组之间的占比（百分率）无显著差异。A试验组GnRH处理时，卵泡最大直径的大小（2 mm间隔）对受精率无显著影响；但存在正相关（P=0.609）；卵泡最大直径不小于13 mm的母牛受孕率，趋向高于卵泡最大直径12 mm的母牛受孕率（P=0.06）。

A试验组母牛同步排卵率[89.2%（66/74）]比对照-1组的[33.3%（24/72）]高，差异极显著（P＜0.01）。A试验组母牛人工输精受精率[100%（134/134）]高于对照-1组[87.0%（120/138）]和对照-2组[64.4%（197/306）]，差异极显著（P＜0.01）；对照-1组又高于对照-2组，差异极显著（P＜0.01）。对照-1组PGF处理时与人工输精的间隔时间是（88.2±20.6）h。

A试验组、对照-1组和对照-2组母牛的受孕率分别是60.4%（81/134）、59.2%（71/120）和70.1%（138/197），3 个组之间差异不显著（P＞0.05）。对照-1组中，源于3 个牛场的母牛受孕率[50%（36/72）]，类似源于另外5 个牛场的母牛受孕率[53%（35/66）]。A试验组的母牛受孕率[60.4%（81/134）]，高于对照-2组的母牛受孕率[41.5%（138/306）]，差异显著（P＜0.05）；趋向高于对照-1组的母牛受孕率[51.4%（71/138）]（P=0.08）。

PGF处理时，（后来）妊娠的母牛最大卵泡直径[（10.0±0.05）mm]，类似于没有妊娠的母牛最大卵泡直径[（9.11±0.04）mm]（P=0.21）；（后来）妊娠的母牛的黄体直径[（20.9 ±0.30）mm]显著大于没有妊娠的母牛的黄体直径[（19.8 ±0.42）mm]（P＜0.05）；（后来）妊娠的母牛的黄体体积[（4.11±0.77）cm3]极显著大于没有妊娠的母牛的黄体体积[（3.24±0.80）cm3]（P＜0.01）。GnRH处理时，（后来）妊娠的母牛最大卵泡直径[（12.4 ±0.04）mm]，显著大于没有妊娠的母牛最大卵泡直径[（11.1±0.05）mm]（P＜0.05）。

3 讨论

有报道称，荷斯坦母牛卵巢黄体直径不小于20 mm时，可分泌有功能作用的孕酮。本试验98.9%的母牛（黄体直径不小于18 mm）的孕酮浓度不小于1.0 ng/mL（有功能作用），表明超声波检测可为黄体功能评价提供充分和客观的方法。PGF（前列腺素F2α）处理时卵泡的最大直径与（后来的）受孕率没有显著的联系，可能原因是人工输精不在同一地点或不是同一人操作、排出的卵泡并不总是最大直径的卵泡。又据报道，GnRH（促性腺释放激素）处理肉牛诱导排卵时，卵泡直径不大于11 mm会降低受孕率、增加胚胎死亡或死胎率；本试验发现，GnRH处理时，卵泡直径更大（不小于18 mm），受孕率更高，与此吻合。定时人工输精后24 h内的同步排卵率为89.2%（而不是100%），可能是牛的脑垂体对GnRH反应减弱，导致黄体生成素（LH）释放减少；排卵延迟、卵泡衰老，导致（后来的）受孕率降低。A试验组母牛人工输精受精率为100%、2 个对照组的受精率分别是87.0%和64.4%，说明平常单靠肉眼观察母牛发情后再输精是不准确的，而用超声波检测要准确得多，因为人工输精时，有些母牛无黄体或无卵泡排出，也就不会受孕。

因此，便携式超声波扫描仪是检测母牛卵巢黄体是否存在的实用工具，PGF处理时黄体的大小与（后来的）受孕率密切相关。当检测到母牛卵巢黄体直径达到或超过18 mm时，给母牛肌肉注射PGF（0.5 mg氯前列烯醇---前列腺素F2α）；56 h后再肌肉注射GnRH（100 μg醋酸发酵素---促性腺释放激素，一种垂体激素释放兴奋药）；注射之后16～20 h之内，进行定时人工输精，可实现同期发情、同步排卵、同期受精；提高受孕率和牛场生产管理水平。国内已将便携式超声波扫描仪用于奶牛和肉牛的妊娠诊断，应尽快应用于母牛卵巢黄体检测，实施同期排卵，提高人工授精的受孕率。