土拨鼠肝炎病毒感染模型在乙型肝炎研究中的应用

艾灵，朱彬，王俊忠，陆蒙吉，杨东亮，王宝菊*

(1. 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染性疾病科，武汉 430022； 2. 德国Duisburg-Essen大学医院病毒研究所，德国埃森 D-45122)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的乙型病毒性肝炎是严重影响人民身体健康的传染性疾病。全世界约有20亿人曾感染HBV，其中至少2.4亿患者为慢性HBV感染者，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国是HBV感染的高发区，虽然乙肝疫苗计划接种成功地将五岁以下幼儿的HBsAg携带率降至1%以下，但HBsAg的整体携带率仍高达7.18%，据此推算我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。虽然慢性乙型肝炎及其引发的肝衰竭、肝硬化、肝癌问题仍十分严重，但因其发病机制不明且现有的抗病毒药物如干扰素和核苷类似物的治疗效果不佳，乙型肝炎的防控形势仍非常严峻。HBV相关科研机构及药物研发企业仍在不断探索以期找到更好的HBV防控药物或生物制剂，而这些药物、生物制剂以及一些联合治疗策略的临床前评价均离不开合适的细胞和动物模型。HBV具有严格的种属特异性，仅能感染人、黑猩猩和树鼩，因此与HBV同属嗜肝DNA病毒家族的土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus, WHV)以及鸭乙肝病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)感染的土拨鼠和鸭乙肝模型在乙型肝炎相关研究中应用广泛[1]。本文主要综述了WHV感染土拨鼠模型的免疫学特征，以及该模型在抗乙肝病毒药物评价和免疫调节治疗中的应用。

1 土拨鼠/旱獭WHV感染模型

WHV的发现可追溯到19世纪80年代，它在美国费城动物园患肝癌的东方土拨鼠(以下均简称土拨鼠)中首次被发现[2]。WHV与HBV同属嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属，两者基因结构非常相似，并在核酸序列和氨基酸水平上具有高度同源性，其生物学特性和复制过程实际上是基本相同的[3]。此外土拨鼠WHV感染后的血清学和病理学特征类似于人类HBV感染，例如其血清中除检测到完整病毒颗粒外，也可检测到由WHV表面蛋白组成的杆状和小球形颗粒[4]。不仅如此，WHV感染土拨鼠后的自然经过也与人感染HBV高度类似。人HBV感染后的结局与感染时的年龄明显相关，成人感染后仅5% ～10%发生慢性化，而90%的围产期感染后发展为慢性感染。成年土拨鼠WHV感染后慢性化率低于5%，而幼年土拨鼠WHV感染的慢性化率可达60% ～75%[5]。此外，土拨鼠急性WHV感染被清除后，其肝脏内仍能检出痕量的WHV DNA及残存的炎症反应，这可能是急性乙肝感染恢复后仍不能完全避免HCC发生的原因[6]。

东方土拨鼠(Eastern woodchuck)亦称美洲土拨鼠(American woodchuck)，是Marmotamonax的俗称，为松鼠科(Sciuridae)旱獭属(Marmota)动物，亦可译为美洲旱獭，分布在美洲大陆，引入国内非常困难，特别是WHV感染的土拨鼠，且价格高昂，在我国广泛应用存在一定局限性。我国西北地区也有旱獭分布，主要有喜马拉雅旱獭(Marmotahimalayana)、灰旱獭(Marmotabaibacina)和长尾旱獭(Marmotacaudata)等。我们研究发现喜马拉雅旱獭(以下简称旱獭)对WHV高度易感，WHV感染后第2～4周血清中检出WHsAg、WHV DNA，第4～6周检出WHcAb，在第10周处死动物采集肝组织样本，在肝内检出HBV复制中间体、WHsAg和WHcAg，其感染经过和成年土拨鼠WHV感染过程非常相似[7]。应用RNA-seq技术，我们比较了土拨鼠和旱獭转录序列同源性，结果发现74%的序列同源性高达90% ～100%，9.9%的序列同源性高达80% ～90%，7.67%的序列同源性高达60% ～70%，提示二者转录组序列高度同源[8]。因此在下文中我们将东方土拨鼠模型和喜马拉雅旱獭模型统称为土拨鼠模型。

2 土拨鼠WHV感染后的免疫学特征

越来越多的研究表明抗病毒药物联合免疫调节治疗是实现慢性乙肝临床治愈最有可能的方案。要将土拨鼠WHV感染模型用于免疫调节治疗研究需首先建立土拨鼠免疫学研究手段，以便对该模型WHV感染后的免疫学特征进行研究。近年来，多种土拨鼠天然免疫、获得性免疫分子被克隆，病毒特异性T细胞应答检测方法的建立，大大促进了土拨鼠模型在乙肝免疫发病机制研究中的应用。

2.1 模式识别受体

模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)是病毒感染启动天然免疫并介导获得性免疫的重要分子。目前多种土拨鼠PRR已被成功克隆和进行功能分析，包括Toll样受体(toll-like receptor, TLR)2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、干扰素γ诱导蛋白16(gamma-interferon-inducible protein 16, IFI16)、AIM-2(absent in melanoma 2)和维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)。我们的研究发现TLR2的配体可激活NF-κB、PI3K/Akt和部分MAPK信号通路，诱导肝细胞产生促炎细胞因子。TLR2配体刺激诱导的天然免疫应答可降低HepG2.2.15细胞中HBV与土拨鼠原代肝细胞中WHV的病毒复制和基因表达水平。土拨鼠WHV慢性感染时，外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和肝组织中TLR2的表达水平相对较低，而急性感染或恩替卡韦经治的慢性感染土拨鼠，其PBMC中TLR2表达水平与WHV DNA滴度呈负相关[9]。上述研究提示肝细胞在嗜肝DNA病毒感染TLR2介导的抗病毒应答中发挥重要作用，TLR2信号在急慢性WHV感染时的差异或许对慢性乙肝的免疫治疗有参考价值。我们的研究也发现土拨鼠IFI16和AIM2在DNA介导的IFN-β和IL-1β的诱导中可能分别起关键作用；IFI16和AIM2转录物在急性WHV感染后肝脏和脾脏中上调，而IFI16在慢性感染后肝脏中下调，IFI16的配体VACV ds 70 mer体内转染导致IFI16和IFN-β的上调，提示IFI16有可能作为HBV治疗的新靶标[10]。

2.2 细胞因子及其受体

α干扰素(interferon α, IFN-α)被广泛用于慢性乙肝的抗病毒治疗，然而其应答率不高。近年来，关于土拨鼠IFN-α的认识越来越深入。有两种亚型的土拨鼠IFN-α最早被发现，通过腺病毒载体将IFN-α基因导入来自WHV慢性感染土拨鼠的原代肝细胞内，可使肝细胞内WHsAg呈剂量依赖性降低[11]。随后10个亚型的土拨鼠IFN-α和8个亚型的旱獭IFN-α被发现，二者具有非常高的同源性[12-13]。在Poly(I:C)刺激下，未感染WHV的土拨鼠PBMC可产生1、4、5型IFN-α，提示土拨鼠IFN-α亚型在PBMC呈选择性表达；而慢性WHV感染土拨鼠PBMC的IFN-α产量减少，提示慢性HBV感染者的IFN应答受损。土拨鼠和旱獭1型干扰素受体(IFNAR1/2)序列已成功鉴定[14]。在IFNα/γ的刺激下，土拨鼠原代肝细胞IFNAR2的表达水平显著升高，而慢性感染时IFNAR1和IFNAR2的表达水平则降低[15]。用重组的土拨鼠IFN-α治疗慢性WHV感染土拨鼠15周后，通过RNA-seq 检测肝内转录组学的改变，结果IFN-α诱导的抗病毒效应与肝内IFN刺激基因的表达没有明显相关性，而与肝内NK/T细胞的转录标志相关，提示IFN-α诱导的抗病毒效应更多地与NK/T细胞介导的细胞杀伤效应和非细胞杀伤效应相关[16]。

白介素10(interleukin 10, IL-10)是一种重要负向免疫调节分子，通过与其受体(IL-10R)结合发挥免疫抑制功效。土拨鼠的IL-10R已被克隆，并制备了其特异性多抗，该抗体能在体外使来自慢性WHV感染土拨鼠的病毒特异性T细胞的增殖和脱颗粒功能明显增强[17]。

白介素12(interleukin 12, IL-12)在诱导抗病毒细胞免疫应答中发挥重要作用。研究表明肝内注射携带IL-12基因的腺病毒载体，仅能在低病毒载量的慢性WHV感染土拨鼠中发挥很好的抗病毒效应[18]。在高病毒载量动物体内不能很好地发挥抗病毒效应可能与TGF-β和Treg有关，在体外阻断TGF-β和敲除Treg能恢复T细胞对IL-12的应答，然而在体内联合TGF-β抑制性多肽和敲除Treg仍不能发挥很好的抗病毒效应[19]。

白介素15(interleukin 15, IL-15)在天然和获得性免疫自稳中发挥重要功能。我们克隆了土拨鼠和旱獭IL-15分子，并发现重组的IL-15蛋白能增强活化的小鼠脾细胞及土拨鼠PBMC增殖功能，慢性WHV感染土拨鼠肝脏内IL-15的表达轻度上调[20]。

2.3 T细胞应答

已有研究表明，病毒特异性的T细胞应答在HBV清除中发挥重要作用。T细胞表面标志是区分T细胞亚群的先决条件，且在T细胞功能分析中不可或缺。土拨鼠CD4、CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、Tim-3、Galectin-9等T细胞表面标志均已克隆鉴定[21-26]。我们制备的抗土拨鼠CD4单克隆抗体(G2)在体外能有效抑制ConA诱导的淋巴细胞增殖，在健康土拨鼠体内能清除60% CD4+T细胞，余下的CD4+T细胞仍能保持对ConA刺激的反应性[23]。土拨鼠慢性WHV感染时CD8+T细胞上PD-1的表达水平明显升高，且与WHV病毒载量呈正相关；恩替卡韦治疗时，随着病毒载量的下降，CD8+T细胞上PD-1表达水平随之下降[25]。急慢性WHV感染时PBMC上PD-L1的表达均明显上调，体外阻断PD-L1 和PD-L2 能部分上调WHV感染土拨鼠PBMC的增殖和脱颗粒功能[26]。

检测病毒特异性T细胞功能是将土拨鼠模型用于免疫发病机制和免疫调节治疗的先决条件。最早建立的土拨鼠T细胞功能检测方法是基于同位素氚[3H]标记的腺嘌呤的淋巴细胞增殖实验，使用WHV抗原刺激土拨鼠PBMC后用液体闪烁计数仪检测被细胞摄取的氚[3H]标记的腺嘌呤数量。应用上述方法，Menne等[27]发现WHV感染3周即可检出强烈的针对WHsAg、WHcAg以及WHcAg 97-110aa多肽的T细胞应答，并在病毒清除期达到高峰。病毒清除1年后，病毒特异性T细胞应答仅能在WHV再次接种后检出。新生土拨鼠接种WHV后，清除WHV的个体在急性期即可检出强烈且多特异性的病毒特异性细胞免疫应答，而WHV持续感染的个体则缺如或应答不足[28]。随着流式细胞术的发展，基于羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)的土拨鼠淋巴细胞增殖流式分析方法随后也被建立[29]。CD107a可以作为细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)脱颗粒的标志，可被用于检测抗原特异性的CTL应答[30]。应用建立的CD107a脱颗粒流式细胞技术，Frank等[31]发现：急性WHV感染的土拨鼠PBMC，用WHcAg 96-110aa多肽刺激后，从病毒复制的高峰期至感染后15周均能检出强烈的CTL应答；而慢性WHV感染土拨鼠则不能检出病毒特异性CTL应答。上述研究结果均与在人HBV感染及黑猩猩HBV感染中的T细胞应答高度近似。

3 土拨鼠WHV感染模型在抗病毒药物评价中的应用

目前临床上使用的核苷类似物包括拉米夫定(lamivudine, LAM)、阿德福韦酯(adefovir, ADV)、恩替卡韦和替诺福韦(tenofovir, TDF)均在土拨鼠模型进行了评价。以替诺福韦为例，土拨鼠分别按每日0.5、1.5或5.0 mg/kg的剂量用替诺福韦处理4周，血清WHV DNA水平均显著降低，但血清WHcAb和WHsAb、肝内WHV RNA无显著变化[32]。其中部分动物血清中WHsAg、肝内WHV复制中间体和肝内WHV抗原表达也出现一过性降低[32]。联合抗病毒治疗是HIV感染的标准治疗方案，联合抗病毒治疗能否在HBV治疗中取得更好的治疗效果及其安全性在TDF上市之初就在土拨鼠模型中进行了评价。该研究发现ADV和LAM联用、TDF和恩曲他滨(emdtricitabine, FTC)联用24周，能显著降低土拨鼠WHV病毒血症水平，上述四种药物单独和联用48周均未见明显的生理、生化及血液学异常[33]。为验证新药在土拨鼠模型抗WHV疗效能否预测该药在慢性乙肝患者中抗HBV的疗效，研究者在LAM上市之初就进行了下面的研究。四种当时已在临床上使用的抗病毒药物阿糖腺苷、病毒唑、LAM和泛昔洛韦在土拨鼠模型中抗WHV的疗效与慢性乙肝患者抗HBV临床研究中的疗效类似，均可降低WHV病毒血症和肝内WHV DNA复制水平[34]。和慢性乙肝患者的临床研究结果类似，齐多夫定对WHV的复制无影响。这进一步说明WHV慢性感染的土拨鼠模型可以作为慢乙肝抗病毒治疗药物的精准研究模型。

除核苷类似物外，土拨鼠模型最近也被用于TLR7刺激剂GS-9620的临床前研究[35]。研究发现GS-9620可快速、显著且持续降低土拨鼠血清WHV DNA、肝内WHV DNA复制中间体、肝内WHV cccDNA和WHV RNA水平，使血清WHsAg水平低于检测下限。GS-9620还可诱导部分土拨鼠对WHsAg产生持续的抗体应答，在持续低病毒载量的土拨鼠中显著降低肝癌的发生率[35]。上述研究提示TLR7激动剂GS-9620的短期使用可诱导WHV慢性感染的土拨鼠产生持续的抗病毒应答，有可能在慢性乙肝患者中实现功能性治愈。

虽然土拨鼠模型在核苷类似物及TLR7激动剂中的研究结果能够很好地预测这些药物在慢性乙肝患者中的抗HBV疗效，然而最近的研究也有不同发现。核酸聚合物(nucleic acid polymers, NAP)被发现可阻断HBV感染肝细胞中HBsAg的释放。NAP可清除DHBV感染时的血清DHBsAg，并显著降低甚至清除人HBV慢性感染或HBV/HDV重叠感染时的HBsAg。虽然在土拨鼠和小鼠肝内均能检出两种NAP REP 2139和REP 2055的聚集，然而上述两种NAP在WHV感染土拨鼠、HBV感染SCID-Hu小鼠及HBV转基因小鼠中均未能检出很好的抗WHV或抗HBV效应。推测可能是啮齿类动物肝细胞中表面抗原颗粒的装配及分泌不同于人HBV和鸭DHBV[36]。

4 土拨鼠WHV感染模型在免疫调节治疗中的应用

病毒特异性的T细胞应答在HBV清除中发挥重要作用，其功能缺失是HBV感染持续的根本原因。核苷类似物治疗只能暂时恢复HBV特异性的CTL功能[37]。与此类似，土拨鼠WHV慢性感染时，恩替卡韦治疗也只能诱导短期的CTL应答[25]。因此抗病毒治疗联合免疫调节治疗可能是实现慢性乙肝临床治愈最有可能的方案。

表达WHV核心抗原的DNA疫苗初次免疫和腺病毒疫苗增强免疫在小鼠和土拨鼠中均能诱导强烈的CD8+T细胞应答。将其与恩替卡韦联合使用后，可使WHV慢性感染的土拨鼠产生WHsAg 和WHcAg特异性CD4+和CD8+T细胞应答，且持久抑制WHV复制，维持低水平WHsAg。其中4只土拨鼠中有两只在恩替卡韦停药后仍维持WHsAg的血清学转换[38]。上述研究结果提示抗病毒治疗联合DNA疫苗初次免疫-腺病毒疫苗增强免疫的新方案有可能成为慢性乙肝治疗的新方案。

乙肝疫苗需冷链保存，在偏远农村地区的普及难度较大，且乙肝疫苗仍存在血源性病原感染的风险。最近我们也在土拨鼠模型中评价了抗病毒药物联合疫苗免疫在HBV暴露后预防中的价值。我们发现恩替卡韦单药或联用DNA疫苗，可使土拨鼠在大剂量WHV接种后不出现病毒血症，部分或全部动物产生了保护性免疫可以抵抗WHV的再次感染[39]。基于上述研究，我们提出核苷类似物单独使用或联合乙肝疫苗可能是HBV暴露后预防的替代方案，特别是对发展中国家的偏远农村地区居民、乙肝疫苗无应答者的职业或非职业HBV暴露后预防将大有裨益。

AIC649可直接作用于宿主免疫防御系统的抗原提呈细胞，调节细胞因子的释放和活化T细胞的应答。AIC649对HBV转基因小鼠可产生等同于替诺福韦的抗病毒效应。有趣的是AIC649治疗在WHV慢性感染的土拨鼠产生双向治疗应答，WHV DNA和WHsAg在治疗初期升高，随后则显著降低直至治疗结束后，这可能与AIC649重建WHV特异性免疫应答相关[40]。

慢性病毒感染中PD-1/PD-L1的相互作用对T细胞功能耗竭至关重要，阻断PD-1/PD-L1的相互作用可部分恢复T细胞功能。慢性乙肝患者和慢性WHV感染土拨鼠中病毒特异性T细胞上的PD-1表达上调，体外阻断PD-1/PD-L1的相互作用可部分恢复T细胞功能。无论在慢性乙肝患者还是WHV慢性感染的土拨鼠，恩替卡韦治疗均能降低PD-1的表达。因此抗病毒药物联合PD-1/PD-L1阻断有可能较单用抗病毒药物获得更好的疗效。最近的一项研究发现：在自然感染所致的WHV慢性感染土拨鼠中，PD-L1抗体和恩替卡韦联用比恩替卡韦单药治疗能更好地实现病毒血症和WHsAg的控制，然而仅在少数土拨鼠中实现上述疗效[41]。我们最近还测试了抗病毒药物、DNA疫苗联合PD-1/PD-L1阻断的联合免疫治疗策略。我们发现PD-1抗体、DNA疫苗联合恩替卡韦，可协同增强病毒特异性T细胞的功能，诱导部分土拨鼠实现病毒清除和WHsAg血清学转换[25]。这些研究结果为慢性乙肝的免疫调节治疗策略设计提供了新的可能。

总之，由于WHV和HBV在基因组结构、生物学特性、复制周期、感染后的自然经过及免疫学特征均与HBV高度近似，因而土拨鼠WHV感染模型在抗病毒药物评价方面有较高的应用价值，且已被广泛应用。随着该模型免疫学特征的阐明及免疫学检测方法的完善，其在免疫调节治疗策略及联合治疗策略评估中的应用价值也大大提高。得益于深度测序技术的进展，随着土拨鼠模型转录组学数据的逐步丰富，该模型在生物医药中的应用也将进一步拓宽。然而，仍需注意到啮齿动物和人、WHV和HBV尚存在一定的差异，因此在评价来自土拨鼠模型的研究结果时仍需谨慎。