四物汤对血虚证小鼠肝细胞凋亡相关分子Caspase 8 mRNA表达的影响

王正引，陈 燕，张小如，郭明章

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122； 2.福建中医药大学中医学院，福建福州350122）

中医藏象理论认为肝藏血，是指肝对血液有贮藏，调节及收摄作用。李梴《医学入门》曰：“人身动则血行于诸经，静则藏于肝脏，故肝为血海。”肝血充盈，则脏腑官窍得濡，肌肉毛发可养。肝藏血功能失调，则营血虚损，机体失于濡养，是造成血虚证的主要原因之一。四物汤由熟地、当归、白芍及川芎组成，此四味药均归肝经，功可补血养肝，用于治疗血虚证。本课题组为了探讨四物汤补血养肝的作用机制，在前期研究中发现四物汤可减少血虚证小鼠肝细胞凋亡［1］，下调血虚证小鼠促凋亡基因Bax、Fas mRNA表达［2-3］。半胱天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate-specific protease，Caspase）是凋亡信号传递的交汇节点。Caspase8作为凋亡信号通路下游的关键分子，是细胞凋亡的启动者［4］。本研究通过观察四物汤对血虚证小鼠肝细胞凋亡启动分子Caspase8 mRNA表达的影响，进一步探讨其对血虚证模型肝细胞凋亡影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠，清洁级，8 w龄，24 只，雌雄各半，体质量（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供［动物许可证号：SCK（沪）2012-0002］。

1.1.2 药物及制备 四物汤按《方剂学》教材［5］规定的剂量称取，熟地15 g，当归9 g，白芍9 g，川芎6 g，按传统方法水煎，煎煮两次，取两次水煎液合并后浓缩，每mL药液含生药量约0.25 g，置4℃保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 注射用环磷酰胺（通化茂祥制药有限公司，批号：120801）；Trizol（大连宝生物工程有限公司）；2×SYBR real-time PCR premixture、cDNA第一条链合成试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（瑞士Roche公司）；XT2000iv全自动血液分析仪（日本Sysmex公司）；DYCP-31DN电泳仪（北京六一仪器厂）；ABI7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；5417R低温离心机（德国Eppendorf公司）；GDS-8000凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及造模 24只C57BL/6J小鼠按随机数字表法随机分为3组，每组8只，分别为空白组、模型组、给药组。小鼠常规饲养1 w适应环境后，参照化学损伤法［6］造模，模型组、给药组于实验第1 d按小鼠体质量0.1 g/kg腹腔注射环磷酰胺1次，环磷酰胺作为细胞周期非特异性细胞毒药物，可抑制骨髓造血，从而建立血虚模型。空白组予等体积生理盐水腹腔注射。

1.2.2 动物给药 按人与小鼠体表面积折算的等效剂量比计算小鼠给药剂量［7］，给药组予四物汤按5 g/（kg·d）剂量灌胃。每日1次，连续灌胃7 d。空白组和模型组则给予等体积的生理盐水。

1.2.3 外周血象检测 在实验第7 d，给药1 h后，每只小鼠眼眶后静脉丛取血约0.1 mL，以全自动血液分析仪检测外周血红细胞数、白细胞数、血小板数及血红蛋白含量。

1.2.4 肝细胞凋亡检测 在实验第8 d，颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取肝脏，4℃预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，肝右前叶切取1.0 cm×1.0 cm×1.0cm组织块，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，以TUNEL试剂盒检测肝细胞凋亡百分率。

1.2.5 Caspase8 mRNA表达的荧光定量PCR检测 按Trizol法提取总RNA。参照cDNA第一条链合成试剂盒说明书逆转录cDNA。 根据Genebank基因序列设计引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR的引物序列

PCR反应体系如下：引物1 μL、cDNA模板2 μL 、ddH2O 7 μL、2×SYBR premixture 10 μL，总体积 20 μL，反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性 20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，反应40个循环。循环结束后，72℃延伸2 min。

记录样本Ct（Cycle threshold）值，参照2-△△Ct法［8］，以 2-△△Ct比较各组 Caspase8 的 mRNA 表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠外周血象的比较

各组小鼠外周血红细胞数、白细胞数、血小板数及血红蛋白含量经Shapiro-Wilk检验及Levene检验，统计结果表明数据符合正态分布且方差齐同。单因素方差分析结果表明，红细胞数及血红蛋白含量总体均数不全相等（P＜0.01）。白细胞数及血小板数各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组相比，模型组外周血红细胞数、血红蛋白含量降低（P＜0.01）。与模型组相比，给药组外周血红细胞数、血红蛋白含量升高（P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组小鼠外周血象比较 （±s）

表2 各组小鼠外周血象比较 （±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05

组别 n 红细胞（1 0 12/L） 白细胞（1 0 9/L） 血小板（1 0 9/L） 血红蛋白（g/L）空白组 8 9.9 3±0.7 5 6.3 1±1.4 9 1 0 1 5.5 0±2 5 4.0 6 1 5 0.7 5±1 1.5 4模型组 8 7.4 5±0.6 4 1） 4.8 8±1.3 1 1 1 2 9.6 3±2 4 1.0 8 1 1 8.7 5±6.9 0 1）给药组 8 8.5 2±0.4 3 2） 6.7 4±1.9 4 1 1 6 5.8 8±2 6 1.7 6 1 3 2.1 3±6.2 7 2）F值 3 2.0 7 2.9 7 0.7 7 2 8.1 8 P值 ＜0.0 1 0.0 7 0.4 7 ＜0.0 1

2.2 各组小鼠肝细胞凋亡百分率的比较

各组小鼠肝细胞凋亡百分率、Caspase8 mRNA 2-△△Ct经 Shapiro-Wilk 检验及 Levene 检验，统计结果表明数据符合正态分布且方差不齐。再运用Nemenyi法进行非参数秩和检验比较各组间差异，自由度v=2，与空白组相比，模型组肝细胞凋亡百分率上升（χ2=11.58，P＜0.05），Caspase8 mRNA 2-△△Ct升高（χ2=11.96，P＜0.05）。与模型组相比，给药组肝细胞凋亡百分率下降（χ2=11.58，P＜0.05），Caspase8 mRNA 2-△△Ct降低（χ2=11.96，P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组小鼠肝细胞凋亡百分率、Caspase8 mRNA表达比较

3 讨论

对于四物汤的作用机制研究，主要集中从免疫功能、骨髓造血功能等方面来探讨。近年来已有研究报道，慢性支气管炎肺气虚证大鼠肺实质细胞凋亡率升高［10］，慢性浅表性胃炎脾虚证大鼠胃黏膜细胞凋亡指数上升［11］。表明中医八纲辨证中的虚证与细胞凋亡存在相关性。因此本研究在肝藏血理论指导下，从细胞凋亡水平探讨四物汤补血养肝作用机制。结果表明四物汤可升高血虚证小鼠外周血红细胞数及血红蛋白含量，减少血虚证小鼠模型肝细胞凋亡，与前期研究结果一致。

而在细胞凋亡的信号传导通路中，Caspase8处于凋亡有序级联反应的下游，是关键的凋亡启动分子。在Fas所介导的外源性凋亡途径中，当细胞膜表面的Fas受体与其配体FasL结合后，Fas受体发生多聚化，使Caspase8激活，再作用于胞浆中其他Caspases，使它们发生逐级活化，引发Caspases级联反应。激活的Caspase8还可启动内源性凋亡途径。Caspase8在胞浆中裂解Bcl-2家族成员BH3结构域凋亡诱导蛋白，诱导线粒体释放细胞色素C，进一步诱发Caspases级联反应。使外源性途径与内源性途径互相联系起来，放大凋亡信号，加速细胞凋亡［12］。

在前期研究中，本课题组探讨了四物汤对血虚证小鼠肝细胞凋亡信号传导通路上游调控基因表达的影响，本研究进一步探讨其对该通路下游调控分子Caspase8 mRNA表达的影响。由于没有已知起始拷贝数的Caspase8标准品，因此本研究采用相对定量的2-△△Ct法比较各组的mRNA表达水平。以GAPDH为内参照基因，待测目的基因为Caspase8，记录样本Ct值，计算2-△△Ct，其数值表示各组目的基因拷贝数是空白组的 2-△△Ct倍，以 2-△△Ct代表各组的mRNA相对表达量。本研究结果表明，四物汤可降低 Caspase8 mRNA 2-△△Ct，下调 Caspase8 mRNA表达水平。提示四物汤减少血虚证小鼠肝细胞凋亡，作用机制可能与其抑制Caspase8激活有关。

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