CSP对改善小鼠睡眠功能的研究

杨文彬，陈 磊，王 美，赵静宇，史向华，薛润苗，郭素萍

（山西省医药与生命科学研究院，山西太原030006）

随着社会的高速发展，生活节奏加快，工作压力增高，失眠现象常有发生，成为许多人的困扰，给生活和工作带来不便，甚至诱发其他疾病的发生，引起人们高度关注［1］。当前在临床上治疗睡眠障碍主要依赖于镇静催眠类药物，但长期服用所伴随产生的毒副作用对患者造成潜在危害［2］。所以，从中医药宝库中研发改善睡眠功能的相关产品备受关注，意义重大。

山西省医药与生命科学研究院生物工程室长期致力于冬虫夏草菌丝的相关研究，积累了丰富经验［3-5］，课题组前期以冬虫夏草、酸枣仁、茯苓提取物为主要原料，结合中医理论及前期基础研发配置成中药复方（简写为CSP）。本实验旨在对CSP改善睡眠功能进行初步评价，为进一步深入研究及开发相关药品、保健品奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠，雄性，清洁级，18～22 g，动物许可证号：SCXK（军）2012-0004。实验动物使用许可证书编号：SYXK（晋）2017-0001。动物饲养12 h昼夜节律光照，温度22℃～26℃，湿度40%～70%。饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号为SCXK（京）2014-0010。

1.1.2 药品与试剂 受试物以冬虫夏草、酸枣仁、茯苓提取物为主要原料配置而成（文中简写为CSP），本受试物由山西省医药与生命科学研究院生物工程实验室制备（样品为棕黄色液体，流动性良好，以虫草含量计算，浓度为0.125 g/mL）；戊巴比妥钠（pentobarbital sodium salt Merck：P11011）；巴比妥钠（分析纯，批号：20170221）；氯化钠注射液（石家庄制药四厂，国药准字H13023200）。

1.2 实验方法

本实验参照《保健食品检验与评价技术规范2003》与《实验药理方法学》（人民卫生出版社，第4版），对CSP进行改善睡眠功能实验评价。

本研究设计3批实验，实验一批进行直接睡眠实验和延长戊巴比妥钠睡眠时间实验，实验二批进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验，实验三批进行巴比妥钠睡眠潜伏期实验。实验结果测定在24℃～25℃安静环境下进行。

1.2.1 分组与给药 每批实验均设CSP高、中、低3个剂量组和1个空白对照组，按随机数字表法随机分组。人用剂量为每日2.5 g/60 kg，即0.042 g/kg（以虫草含量计算）。高、中、低剂量组分别每天灌胃剂量为人用剂量30倍（1.26 g/kg）、20倍（0.84 g/kg）、10 倍（0.42 g/kg），给药30 d。小鼠灌胃体积为20 mL/kg，戊巴比妥钠和巴比妥钠腹腔注射剂量为10 mL/kg。

1.2.2 直接睡眠实验 观察受试组动物给予受试样品，对照组给予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过60 s不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录空白对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间［6］。

1.2.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 为确定戊巴比妥钠最小阈上催眠剂量与最大阈下催眠剂量，以同一批次同一饲养环境小鼠进行预实验。取40只小鼠，按体质量随机分成4组，每组10只，按照体质量分别腹腔注射25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg戊巴比妥钠溶液，记录小鼠30 min内入睡发生率［7］。其中，动物入睡发生率100%，但又不使动物睡眠时间过长的戊巴比妥钠剂量作为最小阈上剂量；动物入睡发生率10%～20%的戊巴比妥钠剂量作为最大阈下剂量。动物末次给药与应用给予溶剂及高、中、低CSP 1 h后，给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠最小阈上催眠剂量，注射量为0.1 mL/10 g，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

1.2.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验 动物末次给予溶剂及高、中、低CSP 1 h后，各组动物腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量，记录30 min内入睡动物数（翻正反射消失达1 min以上者）。

1.2.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 做正式实验前先进行预实验，确定动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠的最小阈上剂量（200～300 mg/kg），用此剂量正式实验［8］。动物末次给予溶剂及高、中、低CSP 10～20 min后，给各组动物腹腔注射巴比妥钠，注射量为0.2 mL/20 g，以翻正反射消失为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

1.3 统计学方法

用SPSS17.0软件统计处理。睡眠时间与睡眠潜伏期为计量资料，采用方差分析，方差齐，计算F值。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态分布或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。入睡动物数为计数资料，用χ2检验。

2 结果

2.1 直接睡眠实验

连续给予 1.26 g/kg、0.84 g/kg、0.42 g/kg 剂量的受试物及溶剂30 d后，观察60 min内小鼠的活动情况，在此期间各组动物均未见翻正反射消失，且行为活动正常。说明CSP没有直接催眠的功能。

2.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

阈剂量筛选：不同剂量（25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg）戊巴比妥钠使小鼠30 min内的入睡发生率分别为20%、30%、80%、100%。根据实验结果，确定戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量为25 mg/kg，最小阈上催眠剂量为40 mg/kg。CSP对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响见表1、图1。中剂量和高剂量CSP能明显延长小鼠睡眠时间，与对照组对比差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 CSP对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响 （±s）

表1 CSP对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.01

组别 剂量（m g/k g） n 睡眠时间（s）对照组 0 1 2 7 8 5.0 8±2 2 9.7 1低剂量组 0.4 2 1 2 8 3 8.9 2±2 0 9.4 7中剂量组 0.8 4 1 2 1 2 4 2.0 8±2 5 1.6 2 1）高剂量组 1.2 6 1 2 1 1 6 5.9 2±2 8 8.8 5 1）

图1 CSP对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响

2.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

连续给予高、中、低剂量的受试物，小鼠睡眠发生率与对照组比较均有增加趋势，但用χ2检验计算得出差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 CSP对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响 （±s）

表2 CSP对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响 （±s）

组别 n 入睡动物数 入睡动物发生率（%）对照组 1 5 2 1 3.3 0低剂量组 1 4 2 2 1.4 0中剂量组 1 5 3 2 0.0 0高剂量组 1 4 3 1 4.3 0

2.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

用相同批次、相同饲养环境小鼠进行预实验，确定动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠的剂量，即最小阈上催眠剂量为300 mg/kg。

对照组及低、中、高剂量样品组动物睡眠潜伏期见表3、图2。进一步两两比较得出，低剂量动物睡眠潜伏期与对照组相比均值降低，但差异无统计学意义；中剂量组和高剂量组的动物睡眠潜伏期与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

表3 CSP对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响 （±s）

表3 CSP对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.01

组别 剂量（m g/k g） n 睡眠潜伏期（s）对照组 0 1 4 1 8 4 5.0 7±3 2 6.9 0低剂量组 0.4 2 1 4 1 6 7 7.8 6±5 8 9.5 5中剂量组 0.8 4 1 2 1 3 3 9.7 5±3 8 6.9 9 1）高剂量组 1.2 6 1 4 1 2 3 8.5 7±3 8 9.0 2 1）

3讨论

图2 CSP对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

本文通过对CSP改善睡眠功能的研究，结果表明，CSP没有明显直接催眠作用，中剂量组和高剂量组均能明显延长戊巴比妥钠睡眠时间和巴比妥钠睡眠潜伏期时间（P＜0.01），根据《保健食品检验与评价技术规范》可说明CSP具有改善睡眠功能的作用，可作为进一步开发理论依据。

本次实验研究的受试物CSP中冬虫夏草、酸枣仁、茯苓为主要原料，吴垠等［9-10］通过光电法对正常小鼠自主活动的影响、延长戊巴比妥钠睡眠时间和戊巴比妥钠睡眠时间阈下剂量催眠实验等，进行了虫草菌粉有效部位的药效研究，并采用RP-HPLC荧光检测法测定小鼠脑内5-HT、5-HIAA、DA、NE等单胺类神经递质的含量变化，探讨虫草菌粉有效部位镇静催眠的机制。结果表明虫草菌粉有效部位有明显减少正常小鼠自主活动、显著延长戊巴比妥钠睡眠时间和戊巴比妥钠睡眠时间阈下剂量催眠作用，虫草菌粉有效部位可显著降低小鼠脑内单胺类神经递质NE和DA的含量；有镇静和改善睡眠作用，其作用机制可能与降低小鼠脑内单胺类神经递质NE和DA的含量有关。徐煜彬等［11］评价茯苓及其拆分组分的活性，采用东莨菪碱造成小鼠记忆障碍并应用Morris水迷宫实验，观察茯苓及其组分对学习记忆的影响，同时应用抖笼法及戊巴比妥钠协同催眠实验来观察茯苓及其组分的镇静催眠作用，显示茯苓可改善小鼠学习记忆能力且具有镇静催眠作用。金阳等［12］以酸枣仁汤对失眠大鼠睡眠周期的影响进行研究，表明酸枣仁汤对电刺激所致失眠大鼠的睡眠周期有影响，且随着剂量的变化作用不同。

本实验初步验证CSP改善睡眠的药理作用，为进一步阐明该中药复方治疗失眠的理论与技术的科学内涵提供了科学数据。

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