木犀草素固体脂质颗粒包封率测定及抗氧化研究

陈金慧，吴 春

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨150076)

木犀草素(Luteolin)是一种很具有代表性的天然黄酮，被国外确认为是一种法定的食品色素[1].属于弱酸性四羟基黄酮类化合物，目前发现主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄芩属等天然药物中和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果实中，其他如橄榄油和红酒等植物产品以及野凤仙花、百里香草、唇形科植物筋骨草等也含有木犀草素[2].随着对木犀草素研究的深入，发现它具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡以及增敏抗癌药物活性等抗肿瘤作用，而且还具有抗炎、抗氧化以及对神经系统的保护等作用[3].但由于木犀草素在水中的溶解度低，使其应用受到限制.

固体脂质颗粒(solid lipid particles，SLP)是20世纪90年代初逐渐发展起来的继乳剂、脂质体、微粒和毫微粒后一种新型纳米胶囊有效成分的传递系统.它综合了纳米乳和脂质体的优点，具有增加活性物质亲水性、物理稳定性、延长生物半衰期等特点[4-5].将木犀草素制备成固体脂质颗粒以提高其应用价值，本实验对木犀草素固体脂质颗粒的包封率及其抗氧化能力进行研究.

1 仪器与材料

1.1 仪器

ALC-110.4型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱 (上海一恒科学有限公司)；UV-5100B 型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；LD4-2A 型低速离心机(北京医用离心机厂)；R2050型旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)； KQ-25E型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-DⅢ型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DL-CJ-1F型医用型洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)

1.2 材料

木犀草素固体脂质颗粒(实验室自制)；邻苯三酚(上海第二化学试剂厂)；Tris(上海科兴技术有限公司)；抗坏血酸(上海科兴技术有限公司)，其他试剂均为分析纯

2 方法

2.1 木犀草素固体脂质颗粒包封率的测定

2.1.1 空白固体脂质颗粒的制备

采用薄膜超声法制备空白固体脂质颗粒混悬液[6-7].

2.1.2 木犀草素对照品溶液的配制

称取木犀草素50 mg置于100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.5 mg/mL的木犀草素对照品溶液.

2.1.3 木犀草素固体脂质颗粒样品溶液的配制

精密量取木犀草素固体脂质颗粒混悬液0.5 mL，超声(8 min)，移至棕色容量瓶，用无水乙醇定容至50 mL，摇匀即得.

2.1.4 检测波长的确定[8]

以无水乙醇为空白，在200～800 nm范围内全波段扫描.

2.1.5 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，用无水乙醇定容至25 mL.以无水乙醇作为空白样，在353 nm处测其吸光度，以吸光度(A)对木犀草素溶液的质量浓度(C)进行线性回归分析.得到回归方程为：A=0.172 9C+0.037 1,其线性相关系数R=0.9936.

2.1.6 精密度试验[9]

取对照品溶液于353 nm处测定吸光度，于1日内测定5次.

2.1.7 离心强度的选择[10-11]

精密称取40 mg木犀草素，用空白固体脂质颗粒溶液定容至100 mL，在超声波中混匀，备用.分别移取所得到的混合液60 mL，置于6支离心管中，分别在500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 r/min转速下离心4 min，去除上层清液，用移液管移取5 mL乙醇于离心管，振荡溶解沉淀，在353 nm处测吸光度，根据上述线性方程计算得木犀草素的质量比及相应的离心度，实验结果见表5.

2.1.8 离心时间的选择

精密称取40 mg木犀草素，用空白固体脂质颗粒溶液定容至100 mL，在超声波中混匀，备用.分别移取所得到的混合液60 mL，置于6支离心管中，转速为1 500 r/min，于不同的离心时间条件下进行离心，去除上层清液层，移取5 mL乙醇加入上述7支离心管中，使沉淀溶解，于353 nm处测定紫外吸收吸光度(A)值，再根据上述公式计算出木犀草素的质量比以及相应的离心度，实验结果见表6.

2.1.9 分离度重复实验结果

为考察低速离心法对空白固体脂质颗粒和游离木犀草素分离的作用效果，精密称取木犀草素1.0 mg，移取空白脂质体2 mL，超声波混合均匀，在1 000 r/min的离心条件下离心4 min，去除上层清液，用适量乙醇溶解沉淀后，置于353nm处测定A值，计算沉淀的木犀草素质量，平行操作3次，计算出沉淀的木犀草素量分别占总量的平均比例，实验结果见表7.

2.1.10 紫外分光光度法测包封率

取木犀草素固体脂质颗粒样品溶液适量，在1 000 r/min、120 s的条件下，弃去上层清液.用适量乙醇溶解沉淀，以乙醇为空白在353 nm处测定吸光度，代入回归方程计算固体脂质颗粒中游离木犀草素的量，按下式计算包封率，实验结果见表8.

其中：n1为木犀草素的投入总量；n2为游离木犀草素的质量.

2.2 木犀草素固体脂质颗粒抗氧化性能的测定

2.2.1 对DPPH的清除作用[12-13]

DPPH溶液的配制：准确称取DPPH 20 mg，用无水乙醇溶解并定容至250 mL.测定样液分别为木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸，将三种测定样液均配制成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL的乙醇溶液.

按照表1的添加量，在具塞试管中添加反应液，盖塞混匀后静置反应30 min，在517 nm下测定吸光值A0、Ai、Aj.

表1DPPH·试验加样表

A样液/mLDPPH·/mL乙醇溶液/mLA022Ai22Aj22

按下式计算清除率：

其中：Ai为DPPH·与样品液的吸光度；Aj为样品液与溶剂的吸光度；A0为DPPH·与溶剂的吸光度.

2.2.2 对羟基自由基(·OH)的清除作用[14]

采用水杨酸法测定不同质量浓度木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒及抗坏血酸溶液对羟自由基的清除率.

配制8.8 mmol/LH2O2、9 mmol/LFeSO4以及9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液.测定样液分别为木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸，三种测定样液配制质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL.将不同质量浓度的测定样液与H2O2、FeSO4以及水杨酸-乙醇溶液按照表2的添加量加入到同一试管中，最后加入H2O2启动反应，于37 ℃反应30 min，以蒸馏水作为参比液，在510 nm下测定其吸光度Ai，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样液测定吸光度A0.同时考虑到样品溶液本身的吸光值，测定以FeSO4、水杨酸-乙醇溶液、不同质量浓度的样品溶液及蒸馏水混合溶液的吸光值作为样品的本底吸光度Aj.

表2·OH试验加样表

A样液/mLFeSO4/mL水杨酸-乙醇/mLH2O2/mL蒸馏水/mLA02222Ai2222Aj2222

按下式计算清除率：

其中：A0为空白对照液的吸光度；Ai为加入测定样液后的吸光度；Aj为不加H2O2溶液的本底吸光度.

2.2.3 对超氧阴离子(O2-·)的清除作用[15]

采用邻苯三酚自氧化法测定不同质量浓度木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒及抗坏血酸溶液对超氧阴离子自由基的清除率.

配制木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒和抗坏血酸测定样液，质量浓度分别配制成0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL.配制0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.2)缓冲溶液、25 mmol/L邻苯三酚溶液和8 mmol/L HCl溶液.

按表3的添加量添加0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.2)的缓冲液，在25 ℃的水浴锅中预热20 min，然后加入样品溶液(质量浓度变化范围是0.1～0.5 mg/mL)和邻苯三酚溶液混合均匀.将混合液置于25 ℃的水浴锅中反应5 min.最后加入1 mL8 mmol/L的盐酸溶液终止反应.在325 nm处测定吸光值Ai，样品本底组吸光值Aj及空白对照组吸光值A0.

表3超氧阴离子清除试验加样表

A样液/mLTris-HCl/mL邻苯三酚/mL蒸馏水/mLA04.50.51Ai14.50.5Aj14.50.5

按下式计算清除率：

其中：A0为空白对照液的吸光度；Ai为加入测定样液后的吸光度；Aj为不加邻苯三酚溶液的本底吸光度.

2.2.4 还原能力的测定[16]

采用铁氰化钾还原法测定不同质量浓度木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒及 抗坏血酸溶液的还原能力.

将木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸配制成0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL质量浓度梯度.取不同质量浓度的样品溶液2.5 mL于试管中，加入0.2 mol/L磷酸盐缓溶液(pH=6.6)2.5 mL和1%铁氰化钾溶液(K3Fe(CN)6)2.5 mL 置于50 ℃水浴20 min后快速冷却，再加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，以3 000 r/min的速度离心10 min后取5 mL上清液，依次加入4 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液(FeCl3)1 mL，充分混匀后静置10 min，在700 nm下测其吸光度，以蒸馏水作参比溶液，吸光度值越高说明还原力越强.

3 结果与讨论

3.1 紫外光谱扫描结果分析

由图1可知，木犀草素固体脂质颗粒的最佳吸收波长为353 nm，且在353 nm处，空白固体脂质颗粒无明显吸收.木犀草素的最佳吸收波长为353 nm.推测木犀草固体脂质颗粒中木犀草素的共轭体系和发色团苯环等结构未发生变化，木犀草素固体脂质颗粒仍然保留木犀草素的结构.故选择353nm作为检测波长.

3.2 木犀草素固体脂质颗粒包封率测定结果分析

3.2.1 精密度试验结果

见表4.

图1 紫外吸收光谱图

序号12345吸光度0.4040.4060.3990.4010.403

计算其日内精密度的RSD=27% ，证明仪器精密度良好.

3.2.2 离心强度选择结果

见表5.

实验结果显示：在离心时间一定的条件下(4 min)，转速为1 000 r/min时，离心率达到最大，提高转速离心率开始无变化后呈微小下降趋势，故选择离心强度1 000 r/min.

3.2.3 离心时间选择结果

见表6.

结果表明：在转速一定的条件下( 1 000 r/min)，离心时间为120 s时，离心率达到最大，延长离心时间，离心率下降，继续延长离心时间，离心率无变化，故选离心时间为120 s.

表5离心强度的选择数据表

离心强度/(r·min-1)50010001500200025003000吸光度0.1640.1840.1840.1570.1540.152木犀草素质量比/mg12.2314.1614.1611.2711.089.44离心率/%0.510.590.590.480.470.46

表6离心时间的选择数据表

离心时间/s306090120150180吸光度0.1530.1440.1450.1730.1510.151木犀草素质量比/mg11.1710.3010.4013.8910.9810.98离心率/%0.460.430.430.580.460.46

3.2.4 分离度重复试验结果

见表7.

表7分离度重复试验结果

序号123平均值分离率/%59.2660.2759.8959.81

结果表明：该离心条件下的分离度接近60%.

3.2.5 紫外分光光度法测包封率

见表8.

表8紫外分光光度法测包封率

序号123平均值包封率/%74.4176.4174.2475.02

结果表明，本实验制得的木犀草素固体脂质颗粒的包封率平均为75.02%.

3.3 木犀草素固体脂质颗粒抗氧化活性测定的结果与分析

3.3.1 对DPPH的清除作用

如图2所示，在0.1～0.5 mg/mL的质量浓度范围内，木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸对DPPH的清除率均随样液质量浓度的升高而增加，三者的清除率由大到小依次为：抗坏血酸>固体脂质颗粒>木犀草素.当质量浓度为0.5 mg/mL时，固体脂质颗粒的清除率达到最大值67%，接近于抗坏血酸的清除率71.6%.结果表明：木犀草素固体脂质颗粒的 DPPH 清除能力较木犀草素高，木犀草素固体脂质颗粒有利于其抗氧化能力的发挥.

图2 木犀草素固体脂质颗粒对DPPH的清除作用

3.3.2 对羟自由基体系的清除作用

如图3所示，在0.1～0.5 mg/mL的质量浓度范围内，木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸对羟自由基的清除率均随样液质量浓度的升高而增加，固体脂质颗粒的清除效果明显高于木犀草素.由于黄酮类化合物有活泼的3，4位酚羟基，能提供活泼的氢离子，从而阻断自由基反应.当样液质量浓度低于0.3 mg/mL时，抗坏血酸清除能力与木犀草素固体脂质颗粒相似；在质量浓度为0.2 mg/mL时，固体脂质颗粒的清除能力高于抗坏血酸；当质量浓度高于0.3 mg/mL时，抗坏血酸的清除能力高于固体脂质颗粒；在质量浓度为0.5 mg/mL时，固体脂质颗粒的清除能力高于抗坏血酸，且木犀草素固体脂质颗粒的清除率达到最大值65%，高于抗坏血酸的清除率63%.结果表明：木犀草素和木犀草素固体脂质颗粒均对羟自由基有一定的清除能力，且将木犀草素制备成固体脂质颗粒明显增加了木犀草素的抗氧化能力.

图3 木犀草素固体脂质颗粒对羟自由基的清除作用

3.3.3 对超氧阴离子自由基体系的清除作用

如图4所示，在0.1～0.5mg/mL的质量浓度范围内，木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸对超氧阴离子的清除率随质量浓度的升高逐渐增大，这是由于木犀草素和木犀草素固体脂质颗粒的质量浓度升高，它们作为自由基的接受体，阻碍自由基连锁反应的能力也就越强，同时增强了清除自由基的能力.当质量浓度低于0.3 mg/mL时，抗坏血酸与固体脂质颗粒的清除率接近且明显高于木犀草素；在质量浓度为0.2 mg/mL时，固体脂质颗粒的清除率高于抗坏血酸；在质量浓度超过0.2 mg/mL后，抗坏血酸的清除率逐渐高于固体脂质颗粒.在质量浓度达到0.5 mg/mL时，固体脂质颗粒的清除率达到最大值74.8%，接近于抗坏血酸的清除率78.5%.结果表明：木犀草素和木犀草素固体脂质颗粒均具有抗氧化能力，且将木犀草素制备成固体脂质颗粒后在一定程度上增强了其抗氧化能力.

图4 木犀草素固体脂质颗粒对超氧阴离子的清除作用

3.3.4 还原能力的测定

由图5所示，在0.1～0.5 mg/mL的质量浓度范围内，木犀草素、木犀草素固体脂质颗粒、抗坏血酸的还原能力随样液质量浓度的升高而增强，在质量浓度为0.1～0.4 mg/mL时，固体脂质颗粒的还原能力高于抗坏血酸；当质量浓度高于0.4 mg/mL时，抗坏血酸的还原能力高于固体脂质颗粒；在质量浓度为0.5 mg/mL时，固体脂质颗粒的清除率达到最大值0.81，接近于抗坏血酸的清除率0.83.木犀草素具有良好的还原能力，表明黄酮是良好的电子供应者，并且制备成固体脂质颗粒后，还原能力增强.黄酮供应的电子除还原能力外，还可以与自由基反应生成稳定的物质，中断自氧化链锁反应.结果表明：木犀草素及木犀草素固体脂质颗粒均具有还原能力，且将木犀草素制备成固体脂质颗粒后其还原能力接近抗坏血酸.

图5 木犀草素固体脂质颗粒的总还原能力

4 结 语

实验采用低速离心法将木犀草素固体脂质颗粒与游离木犀草素分离，该方法具有操作简便，仪器要求低等优点.测定的包封率结果稳定可靠，该方法的关键在于离心转速和离心时间的确定，离心速度过小活性物质沉淀不完全，离心速度过大则固体脂质颗粒易被沉淀，本实验对低速离心的条件进行摸索，最后确定了当离心条件为1 000 r/min、离心时间120 s时，木犀草素固体脂质颗粒与游离木犀草素的分离效果最好，测得3批木犀草素固体脂质颗粒的包封率分别为74.41%、76.41%、74.24%.

实验以木犀草素和Vc作为对照，对木犀草素固体脂质颗粒的抗氧化性进行研究，主要测定其对 DPPH、 羟基自由基、 超氧阴离子和还原能力，木犀草素固体脂质颗粒的清除能力虽比Vc略低但较

木犀草素有了明显的提高，且清除能力随样液质量浓度的增加而提高，当质量浓度达到0.5 mg/mL 时对 DPPH 的清除率最高达到67%，当质量浓度为 0.5 mg/mL 时对羟自由基的清除作用超过Vc，当质量浓度为0.5 mg/mL 时对于超氧阴离子的清除率就可达到74.8%，当质量浓度为0.1～0.4 mg/mL时，木犀草素固体脂质颗粒的还原能力高于抗坏血酸.

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