嵌合抗原受体T细胞在多发性骨髓瘤治疗中的研究进展

董倩倩，吴玮玮，张锡友，陈峰，2△，李丹丹

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种克隆性浆细胞异常增殖的血液恶性肿瘤，其发病率位居血液系统恶性疾病的第二位，多发生于中老年，我国MM发病率约为1/10万［1］，并有逐年增加的趋势。常规化疗的有效率为40%～60%，完全缓解率低于5%，中位生存期不超过3年，约25%的患者能存活5年以上，存活10年的不到5%［2］。近年来，随着新药（如沙利度胺、硼替佐米等）的广泛应用和自体干细胞移植（autologous stem cell transplantation，ASCT）的开展，MM的预后得到了极大地改善，但MM仍不可治愈。随着嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，Car-T）技术在复发/难治性急性淋巴细胞白血病领域的治疗进展［3］，越来越多的学者开始关注该技术在MM及实体肿瘤中的应用。本文对Car-T技术在多发性骨髓瘤治疗中的研究进展做一综述。

1 Car-T技术的工作原理

1.1 Car-T的结构 Car是一种由胞内信号传导区、跨膜区和胞外抗原结合区三部分组成的人工融合蛋白，胞外抗原结合区即识别肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）的抗体单链可变区（single chain fragment variable，scFv），将Car基因在体外进行基因重组，生成重组质粒，在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，经过纯化和大规模扩增的T细胞即为Car-T［4］，其既可特异性识别TAA，又能通过非主要组织相容性复合体（MHC）限制性途径杀伤肿瘤。目前Car-T技术已发展至五代［5］。第一代Car-T胞内信号传导区仅含CD3ζ链或FcRγ链［6］。第二代Car-T胞内信号传导区在一代的基础上添加一个共刺激分子（costimulatory molecule，CM），主要为CD28，另有CD134（OX40）、CD137（41BB）及ICOS等，以增强Car-T细胞毒性作用［7］。第三代Car-T胞内信号传导区共添加两个CM（CM1和CM2），主要为CD28 联合 CD134 或 CD137［8］。第四代 Car-T 又称TRUCK细胞，激活时可以释放细胞因子，招募免疫系统的其他成分放大抗肿瘤免疫效应［9］。第五代Car-T即通用型Car-T，主要通过基因编辑技术“关闭”导致人体排异反应的基因，可以对异体T细胞进行提前制备，随时提供给患者。近日，超级Car-T技术问世，该技术又称为“7x19Car-T细胞”，主要是在以往Car-T基础上将添加了白细胞介素（IL）-7和趋化因子（CCL）19，以此招募更多的T细胞以及DC细胞杀伤肿瘤细胞［10］。

1.2 Car-T的抗肿瘤机制 细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是经抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）激活的CD8+T淋巴细胞，其活化需要双信号途径。第一信号途径为APC上的MHC分子-抗原肽复合体与T细胞上的T细胞受体（T cell receptor，TCR）结合，第二信号为APC上的共刺激分子B7与T细胞上的CD28结合，在这两种信号的共同作用下，T细胞会活化增殖为CTL细胞。当CTL细胞再次遇到携带有相同MHC分子-抗原肽复合体的肿瘤细胞时，就会通过同样的机制与之结合［11］。CTL细胞可通过两种途径杀死肿瘤细胞，一是通过释放穿孔素/颗粒酶等细胞毒素介导靶细胞凋亡，二是效应CTL细胞可表达膜型FasL以及可溶型FasL（sFasL），同时分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α、淋巴毒素（LT）α等效应分子，诱导靶细胞凋亡［12］。

第一代Car-T的信号通过CD3ζ或FcRγ的免疫受体酪氨酸激酶活化基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）传导，缺乏CTL细胞活化需要的第二信号，抗肿瘤作用较弱［13］。第二代Car-T由于加入一个CM，Car-T细胞的存活时间延长，肿瘤定位的Car-T增多，在杀死肿瘤细胞的同时还能完成自身的扩增，抗肿瘤能力有所提高，故临床研究应用最为广泛［14-15］。第三代Car-T细胞含有两个CM，体内扩增和产生细胞因子的能力更强，但具有相当的细胞溶解作用［16］。前三代Car-T细胞在回输前均需对患者进行预处理（全身照射或大剂量化疗），预处理方案的毒性限制了其临床应用［17］。第四代Car-T的出现使患者免受预处理的毒副反应，拓宽了Car-T的临床应用范围。研究者们采用改造后的超级Car-T治疗小鼠肥大细胞癌，几乎所有小鼠能够存活，而常规Car-T疗法的小鼠存活率只有30%左右［10］。

2 Car-T在MM治疗中的临床应用

2.1 抗CD19的Car-T 研究表明在MM中，除肿瘤细胞外，还存在一种免疫表型类似于B细胞的细胞，具有CD19、CD20以及CD45等B细胞的免疫表型，其作用类似于干细胞［1］。MM细胞的增殖分化能力有限，而肿瘤干细胞具有强大的增殖分化以及自我更新的能力，目前，针对CD19的Car-T细胞在血液恶性肿瘤治疗中已表现出了巨大的潜力，如急、慢性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤［18-19］。

Garfall等［20-21］的研究共纳入12例多发性骨髓瘤患者，其中10例患者在接受高剂量马法兰和ASCT后12～14 d接受CTL019（5×107个Car-T细胞）输注，10例患者的中位生存期为185 d（42～479 d），6例有很好的部分反应（very good partial response，VGPR），2例为短暂的部分缓解（partial response，PR），2例疾病进展（progressive disease，PD）；不良反应总体比较轻微，包括轻微的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome CRS）；此外，经测定患者体内仅有0.5%～1.5%的MM细胞CD19阳性，推测抗CD19的Car-T主要攻击对象为CD19阳性的“肿瘤干细胞”，而非MM细胞。

2.2 抗CD138的Car-T CD138（Syndecan-1）是硫酸乙酸肝素蛋白聚糖家族的成员，参与细胞黏附，广泛表达于浆细胞和MM细胞。复发和晚期MM其CD138表达水平高于新发的MM，某些器官如唾液腺、肝脏、皮肤的上皮细胞中也有CD138表达，因此将其作为靶抗原行Car-T治疗存在转氨酶升高、手足皮肤红肿等潜在不良反应［22-23］。Guo等［24］应用抗CD138的Car-T治疗5例复发难治性MM或浆细胞白血病患者，在第2次注射Car-T后4例患者出现了轻微发热；治疗后4例患者评价为疾病稳定（stable disease，SD），1例患者并发帕金森病，并开始接受姑息治疗，评价为PD；经测定，回输的Car-T细胞中31%表达抗CD138。由于该靶抗原潜在的不良反应，未来针对CD138的Car-T技术应注重减轻其毒副反应。

2.3 抗BCMA的Car-T 最近，B细胞成熟抗原（BCMA）作为一种CAR靶抗原在MM的治疗中逐渐引起关注。BCMA（CD269）是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体超家族的成员，高度表达于某些B细胞、浆细胞以及MM细胞，造血干细胞以及血液外组织不表达BCMA。Ali等［25］应用抗BCMA的Car-T治疗12例BCMA阳性的MM患者，所有受试者在输注Car-T前均接受化疗预处理（具体方案：环磷酰胺300 mg/m2+氟达拉滨30 mg/m2，连续输注3 d），以减少调节性T细胞水平并增加IL-15和IL-7等细胞因子水平；10例接受小剂量Car-T的患者中，8例患者获得持续2～12周不等的SD，1例获得PR，1例获得持续8周的VGPR；2例接受大剂量Car-T治疗的患者中，1例获得持续66周的PR，1例获得持续17周的完全缓解（complete response，CR）。Cohen等［26］应用抗BCMA的Car-T细胞治疗6例复发难治性MM患者，1例获得长达7个月的CR，1例在胸腔积液和脑脊液中均发现MM细胞的多发转移患者获得持续5个月的VGPR，其余4例Car-T细胞治疗无效。Berdeja等［27］在2016年12月发表的一篇报道中指出：9例复发/难治性MM患者在接受环磷酰胺/氟达拉滨预处理后接受了不同剂量的BB2121注射（5×107个，15×107个，或45×107个Car-T），接受15×107个Car-T治疗组反应较好，2例患者获得CR，1例VGPR；在5×107剂量组中，3例患者分别获得PR、SD和PD，该组的所有患者都经历了8～11周的疾病进展。Fan等［28］报道了一项正在进行中的Ⅰ期临床试验，19例复发难治性MM患者接受抗BCMA的Car-T治疗，其中18例达到VGPR或CR。

总的来说，BCMA作为Car-T的免疫治疗的抗原靶点，在不同的CAR结构设计、不同剂量的临床研究中都展示出希望，需要进一步研究以确定最佳的BCMA-CAR设计治疗MM。

2.4 抗免疫球蛋白κ轻链的Car-T 考虑到成熟的B淋巴细胞表达的是κ或λ轻链，而不是两者都有，Ramos等［29］开发了一种特定于κ轻链的CAR结构，可以识别并杀伤受限于κ轻链的细胞，保留受限于λ轻链的细胞，达到维持部分体液免疫的目的；在他们的Ⅰ期临床试验中，7例MM患者接受了抗κ轻链的二代Car-T技术治疗，在接受1～2次治疗后，在治疗前2周内循环B细胞数量减少了约50%；7例患者在接受Car-T回输时均处于MM活动期，均曾接受1次或多次化疗，6例患者曾接受ASCT治疗。3例患者在回输Car-T细胞前4周内接受补救性化疗，没有接受补救性化疗或者淋巴细胞不小于500个/μL的患者在回输Car-T细胞前予以12.5 mg/kg剂量的环磷酰胺，治疗后4例患者SD时间持续6周至2年不等，其余3例患者Car-T细胞治疗无效。在CLL和NHL患者中，由于κ轻链表达程度更高，应答也更明显。此Car-T技术耐受性良好，没有患者表现出严重的CRS。

2.5 抗CD38的Car-T细胞 CD38是一种参与细胞黏附、信号转导以及钙浓度调节的跨膜糖蛋白，广泛表达于浆细胞、前体B细胞、T细胞、NK细胞以及髓系前体细胞，在胃肠道、前列腺等器官中也有表达。Drent等［30］证实抗CD38的Car-T可有效杀灭CD38阳性的MM细胞，但同时CD38阳性的正常造血干细胞也被Car-T攻击，引起严重的骨髓抑制。此后Drent等［31］通过改变轻链的结构，优化scFv的亲和力，实现了Car-T细胞特异性攻击CD38阳性的MM细胞。

2.6 抗CD44v6的Car-T细胞 43%的晚期MM可表达CD44v6，相关的Car-T临床试验正在进行中［32］，其缺点在于活化的T细胞、单核细胞及角质细胞也可表达CD44v6抗原。

2.7 抗CD56的Car-T细胞 CD56是一种表达于恶性浆细胞肿瘤的糖蛋白，参与介导细胞间以及细胞和细胞外基质间相互作用，相关的Car-T临床试验正在进行中，但是CD56被证实同样表达于NK细胞、部分T细胞以及神经元细胞，因此这种Car-T治疗存在潜在的神经毒性。

2.8 抗CD70的Car-T CD70是一种仅表达于淋巴组织的糖蛋白，但是绝大多数的MM不表达CD70，相关的Car-T临床试验正在进行中［33-34］，将CD70作为靶抗原是否合适有待验证。

2.9 抗细胞表面蛋白SLAMF7的Car-T 细胞表面蛋白SLAMF7（CD319/CS1）广泛表达于浆细胞、NK细胞、CD8阳性T细胞、活化B细胞、活化单核细胞以及树突状细胞，血液外组织不表达SLAMF7。超过90%的MM表达SLAMF7，而且不受MM病情进展以及化疗药物的影响。elotuzumab是一种靶向SLAMF7的单克隆抗体，证实可以提高MM患者的中位生存期。Wang等［35］利用两种Car-T进行研究，一种靶抗原为B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA），另一种靶抗原为SLAMF7，在小鼠模型上发现抗SLAMF7的Car-T细胞疗效优于抗BCMA的Car-T细胞。

3 Car-T技术存在的问题

Car-T技术虽然已经在MM治疗方面显示出巨大的潜力，但仍然存在一些问题有待进一步探讨：（1）尚需观察病毒载体是否会带来有害的插入性突变。（2）Car-T治疗过程中具有一定的不良反应，如细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征（tumor lysis syndrome，TLS）以及脱靶效应（off-target toxicity）等。（3）Car-T的临床试验结果各个中心结果不一，难以达到统一的标准化治疗。（4）Car-T的设计和培养制备成本过高。

4 展望

针对MM多种靶点的Car-T技术，目前不少国家和地区的医疗机构、科研机构已进行了大量的临床试验。在临床应用过程中，其安全性、Car-T的相关信号通路有待进一步研究。构建多靶向的Car-T能够同时针对多种类型的MM靶抗原，进一步增强其抗肿瘤能力，也是未来Car-T技术需要研究的方向。但是由于其在复发/难治性MM中已显示出显著的治疗效果，因此Car-T免疫治疗在临床中的应用非常值得期待。