质谱快速鉴定血培养阳性标本的方法研究

宋启飞，刘敏雪，李梦娇，刘雅，邓劲，谢轶

（四川大学华西医院，四川 成都 610041）

血培养可有效检测出导致血流感染的病原菌，是临床诊断血流感染的金标准[1-3]。在菌血症、脓毒血症等严重感染患者中，及早使用敏感抗菌药物可有效降低患者的病死率[4]。有研究显示，血流感染病原菌鉴定报告时间每延迟1 h，患者存活率降低7.6%[5]。然而，目前的血培养检验流程中，血培养瓶报阳后，仍需36～48 h才能得到最终的菌种鉴定报告。本研究尝试摸索一种血培养阳性标本的快速、精准鉴定方法，以缩短血培养阳性的周转时间（turnaround time,TAT），为临床医生提供更为及时、精准的用药指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集2016年7月—2016年11月四川大学华西医院临床送检的非重复的血培养阳性标本91份。活性炭血培养瓶（法国生物梅里埃公司），血平板（郑州安图生物技术有限公司），营养肉汤培养基（广东环凯微生物科技有限公司），基质液HCCA（德国Bruker Daltonic公司），75%酒精，75%甲酸。

1.2 仪器与设备

Bact/Alert 3D血培养仪（法国生物梅里埃公司），MALDI-TOF MS检测系统（德国Bruker Daltonic公司），二氧化碳孵箱（日本三洋公司），隔水式恒温培养箱（上海恒一精密仪器有限公司），高速离心机（深圳市科力易翔仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血培养阳性标本处理 将91份血培养阳性标本（活性炭血培养瓶）放入Bact/Alert 3D血培养仪，系统自动孵育和检测，阳性报警时取出血培养瓶，用75%酒精消毒血培养瓶口，抽取阳性瓶内培养液进行涂片和革兰染色。将血培养阳性瓶中的培养液分别转种至肉汤和血平板。将100μl培养液转种至2 ml肉汤管中混匀，振荡孵育4 h，37℃、220 r/min离心，作为肉汤增菌组；同时将100μl培养液转种至血平板，5%～10%二氧化碳孵箱，37℃培养4 h，作为血平板培养组；同时分别转种另一块血平板，5%～10%二氧化碳孵箱，37℃培养24 h，作为对照组。

1.3.2 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser-desorption/ionization time-offlight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）鉴定 ① 4 h肉汤增菌法：取经4 h增菌培养的肉汤1 ml至EP管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清液，取EP管底部1μl细菌沉淀，制备质谱靶板；②4 h血平板培养法：挑取经4 h血平板培养的菌膜1μl制备质谱靶板。室温干燥后，进样至MALDI-TOF MS系统中进行菌种鉴定。用IVD细菌测试标准品进行质谱分析前仪器参数校正，质谱鉴定操作按照质谱仪标准程序进行；③对照组：取培养24 h的血平板上菌落，按上述方法进行质谱鉴定，将鉴定结果作为对照。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较采用四格表χ2检验或Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种方法的细菌质谱鉴定结果总符合率比较

4 h肉汤增菌法的质谱鉴定到种的符合率为46.15%（42/91），4 h 血平板培养法为 89.01%（81/91），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=38.146，P=0.000），4 h血平板培养法细菌质谱鉴定到种的符合率高于4 h肉汤增菌法。4 h肉汤增菌法中43株菌无质谱鉴定结果，占47.25%，3株菌质谱鉴定错误，占3.30%。4 h血平板培养法中3株菌无质谱鉴定结果，占3.30%，4株菌质谱鉴定错误，占4.40%。2种方法无鉴定结果率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=46.547，P=0.000），4 h血平板培养法的无鉴定结果率低于4 h肉汤增菌法。2种方法错误鉴定率比较，经Fisher确切概率法分析，差异无统计学意义（P=0.500）。

2.2 2种方法对革兰阳性菌、革兰阴性菌的鉴定结果比较

91例血培养阳性瓶中，分离出革兰阳性菌40株，革兰阴性菌51株。40株革兰阳性菌中，4 h肉汤增菌法质谱鉴定到种的符合率为30.00%（12/40），4 h血平板培养法质谱鉴定到种的符合率为82.50%（33/40）。51株革兰阴性菌中，4 h肉汤增菌法质谱鉴定到种的符合率为58.82%（30/51），4 h血平板培养法质谱鉴定到种的符合率为94.12%（48/51）。4 h血平板培养法对革兰阳性菌和革兰阴性菌鉴定到种的符合率与4 h肉汤增菌组比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.943和17.654，P=0.026和0.000），4 h血平板培养法对革兰阳性菌和革兰阴性菌鉴定到种的符合率高于4 h肉汤增菌法。

2.3 2种方法对肠杆菌科细菌的质谱鉴定结果比较

革兰阴性菌中肠杆菌科细菌41株，经4 h肉汤增菌后质谱正确鉴定到种28株，占68.29%（28/41）；经4 h血平板培养后质谱正确鉴定到种41株，占100.00%（41/41）。4 h血平板培养法与4 h肉汤增菌法鉴定到种的符合率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=15.449，P=0.000），4 h血平板培养法鉴定到种的符合率高于4 h肉汤增菌法。

2.4 2种方法对其他常见菌的质谱鉴定结果比较

6株鲍曼不动杆菌和5株金黄色葡萄球菌在4 h肉汤增菌法中均未鉴定出结果，在4 h血平板培养法中全部鉴定到种。在凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和念珠菌中，4 h血平板培养法的鉴定符合率也高于4 h肉汤增菌法（χ2=18.114，P=0.000）。2种方法对1株具核酸杆菌和1株咽峡炎链球菌在4 h增菌后均未鉴定成功，但对1株产单李斯特菌，4 h肉汤增菌法可鉴定到种，4 h血平板培养法可鉴定到属。

3 讨论

近年来新发展起来的MALDI-TOF MS相对传统细菌培养鉴定流程，可以更快速、准确地鉴定出血培养阳性标本中的细菌，缩短血培养阳性的实验TAT时间，为临床医生提供更为及时的用药指导。血培养送检规范中要求在抗生素使用前进行血液采集，然而在菌血症、脓毒血症等严重感染的救治过程中患者可能已使用抗生素，之后才采集血培养。采集的血液中含有抗生素会降低血培养阳性率[6]。因而，血培养瓶中往往添加抗生素吸附剂（如树脂或活性炭），可有效吸附一定量的抗生素，从而提高血培养阳性率。然而，血培养瓶中的活性炭成分会干扰质谱的鉴定结果，不利于血培养阳性瓶中病原菌的质谱鉴定。本研究尝试用MALDI-TOF MS对血培养阳性标本经肉汤和血平板增菌4 h后直接质谱鉴定，摸索血培养阳性标本的质谱快速鉴定流程，为临床缩短血培养阳性标本病原菌鉴定时间提供参考方法。

本研究血培养阳性标本检出的细菌中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及表皮葡萄球菌占前3位，是患者感染最普遍的细菌。肠杆菌科细菌和凝固酶阴性葡萄球菌比例与高丽钦[7]、徐修礼[8]等的报道基本一致。肠杆菌科细菌、葡萄球菌是菌血症和败血症的主要病原菌[7]。本研究探索的4 h血平板培养法对肠杆菌科细菌鉴定到种的符合率达100.00%（41/41），对凝固酶阴性葡萄球菌鉴定到种的符合率也可达83.33%（20/24）。该方法能够快速、准确地鉴定出肠杆菌科细菌，对临床医生避免经验用药，减少患者并发症，提高治愈率具有重要的临床意义。

2种方法对革兰阴性菌鉴定符合率均优于革兰阳性菌，与国内外研究报道基本一致[9-12]。其原因可能与革兰阴性菌比革兰阳性菌更易生长，革兰阳性菌对生长条件要求苛刻，不易生长等因素有关。6株鲍曼不动杆菌和5株金黄色葡萄球菌在4 h肉汤增菌后均未鉴定出结果，但在4 h血平板培养后全部鉴定成功，可能是血平板相比肉汤，更有利于鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的生长和质谱鉴定，需进一步实验予以证实。

运用MALDI-TOF MS对细菌进行鉴定时，细菌培养基类型、样品制备方法、离心速度、分析软件等的标准不一样，会对细菌质谱鉴定的结果产生影响[13，14]。本研究中，4 h肉汤增菌法的细菌质谱鉴定符合率较低，这可能与肉汤培养基的营养成分（如蛋白质）、培养基性质及培养方式有关，还需进一步改善该方法的实验流程。

本研究中，4 h血平板培养法细菌质谱鉴定到种的总符合率为89.01%，可快速鉴定血培养阳性标本中的病原菌，并有高鉴定符合率。但本研究存在一定局限性，仅收集91例样本，样本量过少，可能对结果产生偏移，需增加样本数量及菌种的多样性。而该方法对肠杆菌科、葡萄球菌等生长较快的细菌快速鉴定更具优势，对有特殊培养要求的革兰阳性菌等的鉴定符合率相对较低。