CD4+CD25+Treg细胞分泌外泌体在疾病中作用的研究进展①

曹启江 周奕辰 王金岩

(辽宁何氏医学院医学部,沈阳 110163)

调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)是具有免疫调节活性的T细胞亚群，在维持机体的免疫耐受以及调控免疫应答过程中发挥重要作用。Treg细胞通过其表面表达抑制性分子、分泌抑炎性细胞因子，直接发挥细胞毒作用以及改变抗原呈递细胞的抗原提呈功能而发挥免疫调节作用。Treg的数量和功能异常与多种疾病有关。越来越多的研究表明Treg细胞可通过产生外泌体以旁分泌或内分泌方式调控效应性T细胞的功能，进而发挥免疫调节作用，维持自身免疫耐受和调控免疫应答。

外泌体(Exosomes)是指细胞合成并分泌至胞外的纳米级囊泡，其内含有多种DNA和mRNA片段、各种调节性小RNA分子、蛋白质和脂质等多种生物分子。不同的细胞或在细胞的不同状态下释放的外泌体不同，体现外泌体具有异质性。研究发现机体几乎所有的细胞均可产生外泌体，因此推测外泌体可能是人们新发现的细胞之间相互作用的一种新型介质，机体细胞可通过产生外泌体将其所携带的内含物质传递给不同细胞，从而改变相应细胞的生物活性，参与多种生物学作用。

最新研究发现Treg细胞产生的外泌体作用于不同的免疫细胞发挥免疫调节作用。本文对Treg细胞产生外泌体的生物学特点以及其在疾病中的作用做一综述，旨在为研究Treg细胞的生物学功能和其在疾病病理形成中的作用提供理论依据。

1 Treg细胞生物学特征

免疫系统的主要功能是识别并清除异己抗原并对自身组织建立免疫耐受。Treg细胞是一种独特的细胞亚群，在建立机体的免疫耐受和维持机体稳态中发挥重要作用[1]。Treg细胞包括CD4+Treg细胞、CD8+Treg以及NKT细胞等。

CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞属于CD4+T细胞亚群，占正常人外周血及脾脏组织中的CD4+T细胞的5%～10%[2]。其利用细胞表面分子主要包括CD25分子(IL-2受体链，IL-2R)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、程序化死亡配体-1(Programmed death-ligand1,PD-L1)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor,GITR)及人类白细胞抗原-DR(Human leukocyte antigen,HLA-DR)等发挥免疫抑制作用[3-6]。此外，还通过其他多种机制发挥免疫抑制作用[7]，如通过分泌抑制性细胞因子，如IL-10、IL-35或TGF-β来抑制效应性T细胞(T effector cell，Teffs)的生物学功能[8]；通过释放细胞毒性分子如穿孔素或颗粒酶促进Teffs细胞凋亡[9]；通过干扰T细胞代谢来发挥抑制作用，比如Treg细胞表达CD39和/或CD73分子，裂解胞外ATP等物质产生腺苷，促进Teffs细胞的胞内第二信使cAMP升高，进而干扰其代谢、增殖与生物学功能[10]；Treg还可抑制抗原提呈细胞的成熟或诱导耐受性树突状细胞等发挥免疫抑制作用[11]。CD8+Treg细胞主要来源于CD8+CD28-T淋巴细胞，表面表达CTLA-4通过与B7结合发挥调节作用，或者通过分泌IL-10刺激产生CD8+Treg细胞发挥抑制作用。NKT细胞是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁之一，主要发挥免疫调节和细胞毒作用。

因此，普遍认为Treg细胞可通过表面表达多种分子以直接接触方式发挥抑制作用；产生多种抑制性细胞因子和毒性分子等以间接方式作用于其他免疫细胞，发挥免疫调节作用。然而，最新的研究显示Treg细胞以一种新的方式，即产生外泌体，以旁分泌和内分泌方式与其他细胞相互作用，进而发挥其免疫调节作用。

2 外泌体

外泌体是机体细胞合成并分泌到胞外的囊泡，直径通常在30～100 nm，囊泡具有质膜，其内部包裹着丰富的蛋白质、核酸物质和脂类等生物分子[12]。与细胞的质膜类似，外泌体的质膜中含有脂类分子。研究发现外泌体的质膜富含胆固醇、神经酰胺和鞘磷脂以及饱和或单一不饱和脂肪酸。脂类分子可促进外泌体与靶细胞质膜融合，并参与维持外泌体的形态和信号转导[13]。外泌体中的核酸物质来源细胞本身，包括多种DNA和mRNA片段、小分子RNA如microRNA(miRNA)、Small interfering RNA(siRNA)、Long non-coding RNA(lncRNA)和circRNA等。蛋白质成分则包括来源于细胞本身的非特异性保守蛋白质如细胞骨架蛋白、跨膜融合蛋白和热休克蛋白(HSP60/90)等以及特异性蛋白质。外泌体中的特异性蛋白质根据来源细胞不同而各异，如抗原呈递细胞来源的外泌体中富含MHC-Ⅰ类分子、MHC-Ⅱ类分子和B7分子，这些分子均与抗原提呈细胞的抗原提呈功能密切相关[14]；血小板来源的外泌体富含整合蛋白CD41a分子[15]；CD8+T细胞来源的外泌体中富含穿孔素和颗粒酶，作用于靶细胞促进靶细胞凋亡发挥CTL细胞的裂解作用[16]。总之，外泌体中含有多种生物分子，这些分子不仅来源于细胞本身，而且在介导细胞与细胞之间的相互作用中发挥关键作用。细胞通过产生和释放外泌体作为介导机体细胞通讯的一种新型方式。

外泌体的合成和释放是一个连续的复杂过程，主要包括四个阶段：起始、内吞、多泡体形成和分泌[17]。具体的合成和释放过程涉及两种途径：内体蛋白分选转运复合物(Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)依赖和ESCRT非依赖途径。ESCRT由4个复合物组成，包括ESCRT-0到ESCRT-Ⅲ。ESCRT依赖性途径起始于细胞质膜在网格蛋白作用下细胞膜表面受体内陷并导致胞膜内磷酸磷脂酰肌醇泛素化，形成早期内体。然后早期内体经过内部的酸化发育形成晚期内体。在ESCRT复合物、磷脂酶D2(Phospholipase D2,PLD2)、胞内衔接蛋白(Syntenin)以及附属蛋白质(Alix)等作用下晚期内体局部出芽形成多囊泡体(Multivesicular endosomes,MVE)，部分MVE经溶酶体途径被降解，不被溶酶体途径降解的MVE与细胞质膜融合形成外泌体并释放到细胞外基质[18]；ESCRT非依赖分泌途径是在质膜中神经鞘脂神经酰胺的作用下，神经酰胺激活G蛋白耦联的神经酰胺受体，将miRNA和脂筏等生物分子装载进入内体后，进行膜融合释放外泌体到细胞外基质[19]。

最初，外泌体被认为仅仅是细胞处理不需要成分的一种手段[20]，然而，现在人们认为外泌体可富集某些特定的核酸、脂质和蛋白质作为细胞间信号传递媒介，维持正常的细胞稳态过程或病理发展的结果[21]。

3 Treg细胞来源外泌体的发现

在21世纪初人们就发现活化的T细胞可产生外泌体发挥免疫调节作用，随后的研究证明多种免疫细胞包括树突状细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞均可以释放各种不同的外泌体发挥多种生物学作用[22]；Clayton等[23]在人的膀胱癌肿瘤细胞中发现肿瘤细胞可以产生外泌体，该外泌体表达CD73分子，后者可降解胞外单磷酸腺苷(AMP)为腺苷，进而抑制T细胞的活化和效应功能；Li等[24]总结近期Treg细胞的起源与功能分类时，强调外泌体在维持和调节Treg细胞稳态中发挥重要作用。上述研究结果使人们想到Treg细胞能否通过产生外泌体发挥生物学作用。

2013年Smyth等[25]发现Treg细胞经抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激活化后可产生外泌体，这种外泌体质膜表面表达CD25分子和CTLA-4分子等免疫调节分子。将纯化的外泌体与Teffs细胞共培养，发现其可阻止Teffs细胞增殖、抑制分泌效应性细胞因子IFN-γ等，并促进免疫耐受的形成；进一步研究发现Treg产生的外泌体可表达CD73分子通过腺苷/腺苷受体通路激活Teffs细胞的胞内cAMP，抑制Teffs细胞发挥作用，促进免疫耐受的形成[10]。有趣的是，Zhang等[26]利用小鼠B16黑色素瘤的肿瘤模型实验显示CD8+CD25+Treg细胞在活化后可释放外泌体，该外泌体表达很多重要的细胞表面膜分子如CD25和GITR等分子，体外实验表明该外泌体可阻止树突状细胞的抗原提呈并具有抑制T细胞增殖的作用，将体外纯化的外泌体与树突状细胞共同注射B16黑色素瘤小鼠能显著抑制CTL介导的抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤生长；Treg细胞通过释放外泌体抑制抗原提呈细胞与CTL相互作用被随后的实验证实，Xie等[27]研究小鼠黑色素瘤移植模型发现，肿瘤组织中Treg细胞分泌的外泌体表达淋巴细胞功能相关组分(LFA-1)和TCR，抑制DC上抗原肽/MHC复合体的抗原呈递能力或通过过表达FasL分子介导细胞毒作用进而抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。促进肿瘤生长[27]。以上研究表明Treg细胞来源的外泌体通过表达多种表面分子与其他免疫细胞相互作用来发挥免疫抑制作用。

Treg细胞产生的外泌体除表达特定的表面分子发挥免疫抑制作用外，外泌体中还含有多种RNA成分以及胞质成分，通过释放外泌体中的组分与靶细胞相互作用来发挥其生物学功能。Bryniarski等[28]研究过敏性皮炎，利用miRNA-150缺失突变小鼠动物模型发现，T细胞产生的外泌体可特异性利用组分miRNA-150抑制Teffs细胞活性，Treg细胞亦可分泌外泌体将特异性miRNA转移至T细胞，通过抑制T细胞效应基因的表达抑制T细胞的增殖和生物学功能。Chatila等[29]进一步分析表明Treg细胞分泌外泌体诱导免疫耐受，与Okoye观点的一致性。Okoye等[30]的研究发现，Treg细胞产生的外泌体中含有多种调节性RNA成分如miR-155、Let-7b和Let-7d，其中Let-7d可以靶向前列腺素内过氧化物合成酶2(Ptgs2)的合成基因Cox-2，将靶基因沉默可抑制Th1细胞增殖和细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，通过非自主基因沉默抑制细胞因子IL-2和IFN-γ等效应基因的转录和翻译，抑制致病性Th1细胞的活化和发挥其生物学作用，阻止自身免疫病的发生发展[30，31]；Wen等[32]研究年龄相关性血管炎综合征发现，CD8+CD25+Treg细胞分泌的外泌体含有NADPH氧化酶2(NOX2)，过度表达NOX2可恢复CD8+Treg细胞的抑制功能，从而保护高龄个体免受组织破坏性炎症性疾病。以上研究表明Treg细胞来源的外泌体利用非编码RNA作用于靶细胞或内含组分发挥免疫调节作用。

Treg细胞可产生IL-10、IL-35和TGF-β等细胞因子发挥免疫调节作用[8]。Treg细胞是否通过合成外泌体释放这些抑炎性细胞因子发挥免疫抑制作用？Cai等[33]实验证实分离的树突状细胞来源的外泌体上含有IL-35和TGF-β，利用这样的树突状细胞可诱导产生Treg细胞和降低Th17比例，抑制炎症性自身免疫疾病。然而，目前尚未见Treg细胞释放的外泌体中含有上述细胞因子的相关报道以及相关的机制也不清楚。

Treg细胞来源的外泌体内含物收集过程是随机选择母细胞胞质中的生物分子还是靶向富集某些特定的生物分子，对这一问题的回答仍不清楚。Villarroya等[34]研究发现在细胞形成外泌体时，类泛素化的异质核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)可通过结合特定序列来调控分选miRNA。Kelada等[35]对曼氏血吸虫慢性感染的Th2和大肠杆菌感染的Th1免疫应答中Treg细胞的外泌体全基因组测序发现：miRNA-10a和miRNA-182分别是Th1或Th2的关键miRNA可控制IL-2和IFN-γ的表达，进一步研究发现Treg细胞可富集不同性质的miRNA形成外泌体，进而调控效应性CD4+T细胞的生物学作用，发挥免疫抑制功能。基于上述的实验研究我们推测Treg细胞可能在不同的炎性条件下通过选择性富集胞内不同区域的不同胞内组分形成外泌体发挥特定的生物学作用。

总之，以上研究结果表明，Treg细胞产生的外泌体含有多种来自细胞本身的成分如膜表面蛋白质分子、多种RNA甚至细胞因子，可与靶细胞高效作用从而有效地发挥Treg细胞的免疫调节作用。

4 Treg细胞来源的外泌体与疾病

4.1Treg细胞来源的外泌体与移植免疫 移植免疫是指组织或器官移植时，受者的免疫系统与供者的移植物相互作用而发生的细胞和/或体液免疫应答。在移植过程中Treg细胞能够诱导免疫耐受，对移植成功起到关键作用。而Treg细胞来源的外泌体可利用其表面分子和载有的miRNA等组分诱导免疫耐受，预防排斥反应发生。

Yu等[36]研究大鼠肾移植动物实验模型发现，Treg细胞来源的外泌体能够延长同种异体移植物的存活和功能；Agarwal等[37]实验研究进一步证实，Treg细胞来源的外泌体表达CD25和CTLA-4等表面分子，通过抑制Teffs细胞的增殖和活性发挥免疫抑制作用，诱导免疫耐受而阻止发生移植排斥反应。Aiello等[38]利用腺病毒载体转移显性抑制基因核因子激酶抑制子(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK2)阻断NF-κB信号通路获得未成熟树突状细胞，利用该未成熟树突状细胞体外诱导产生Treg细胞，该Treg细胞分泌的外泌体含有miRNA(miR-503、miR-330和miR-9)，miRNA通过干扰T细胞的细胞周期蛋白的表达抑制T细胞增殖；另外，该研究还发现该Treg细胞来源的外泌体含有诱导型NO合成酶(iNOS)可诱导产生大量NO，诱发Teffs细胞凋亡；体内实验发现回输未成熟的树突状细胞诱导的iTreg细胞可有效阻止移植排斥反应，延长肾移植存活的时间，这些结果说明iTreg细胞可通过释放外泌体促进机体对移植物免疫耐受的形成，延长移植物的存活时间[38]。上述研究表明Treg细胞可释放特定的外泌体降低抗移植物免疫应答强度，促进机体对移植物的免疫耐受来延长移植物存活时间。因此，理解和阐明Treg来源的外泌体的作用机制可为实体器官的同种异体移植排斥反应的诊断评估与免疫治疗奠定理论和实验基础。

4.2Treg细胞来源的外泌体与感染性疾病 Treg细胞在抗感染过程中发挥重要的免疫调节作用。Treg细胞可调控抗感染免疫应答的强度来保护机体免受过度炎症反应造成的组织损伤，但是这可能增加病原体持久性体内存活而形成慢性感染或感染性疾病复发的风险。Cook等[39]观察幽门螺旋杆菌感染时发现：胃黏膜局部聚集大量Treg细胞可抑制由幽门螺杆菌感染导致炎症反应引发的胃溃疡，然而该Treg细胞释放的外泌体中含有与该病原体相关组分结合的受体，进而造成病灶转移并发生持续性感染，最终导致慢性溃疡性胃炎直至引发胃癌；Gonzalez等[40]研究慢性人类HIV病毒感染，Treg细胞在局部黏膜的数量和循环明显增加，其一方面降低病毒的拷贝数阻止树突状细胞向T细胞的抗原提呈，一方面通过外泌体含有的CD39促使更多的T细胞转化为Treg细胞而抑制免疫应答。上述研究揭示Treg细胞与病原微生物发生发展的部分分子机制，有助于提高Treg细胞对病原微生物识别的特异性，通过精准的靶向Treg细胞操作可以提高免疫调控的精确程度。

4.3Treg细胞来源的外泌体与自身免疫病 自身免疫性疾病是机体免疫稳态被打破后，发生异常免疫反应而攻击自身抗原，破坏机体自身正常组织和细胞，从而引发的慢性炎症性疾病，Treg细胞的数量或功能异常在平衡免疫反应过程中承担重要角色，对多发性硬化症、类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等自身免疫病起到调节和预防作用[41-44]。如多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)是由T细胞介导的中枢神经系统脱髓鞘疾病，Kimura等[44]研究表明通过Treg细胞来源的外泌体组分Let-7i可阻断胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)与转化生长因子β受体1(TGF-βR1)途径而阻止诱发MS；类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节病变为主的慢性全身自身免疫性疾病，Wang等[43]研究发现Treg细胞可产生外泌体，利用外泌体组分miR-548a-3p干扰调节TLR4/NF-κB信号通路，用于调控RA发生、诊断与治疗；Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一种自身免疫性疾病，由T淋巴细胞介导破坏胰岛-β细胞导致胰岛素分泌绝对不足而发病，Zhou等[42]研究发现组织蛋白酶G(CatG)参与胰岛素原抗原呈递激活T细胞，生成大量Th1细胞降低Th2和Treg细胞数量导致胰岛-β细胞受到破坏发生T1DM，实验研究表明干扰下调CatG表达可降低T1DM。因此，可以利用Treg细胞来源的外泌体miRNA干扰CatG作为一种治疗T1DM的手段。

Treg细胞来源的外泌体miRNA可通过基因沉默，抑制Th1细胞增殖和细胞因子的产生来抑制自身反应性T细胞，或者通过含有抑制性细胞因子和表面分子结合靶细胞来抑制免疫应答，参与自身免疫耐受和免疫过程的建立、维持与调节[45]。

4.4Treg细胞来源的外泌体与肿瘤 肿瘤微环境是由肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、炎症细胞及细胞外基质共同构成的有利于肿瘤起始、生长、入侵和转移的局部病理环境，其中存在大量的Treg细胞、髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)等免疫抑制性细胞，这些细胞及其活性分子构成免疫抑制微环境，促进肿瘤免疫逃逸。外泌体参与肿瘤转移、促进血管生成、缺氧、TGF-β信号、连环蛋白信号以及EMT信号促进肿瘤微环境形成，而Treg细胞来源的外泌体可反映母细胞的状态与胞内情况，其产生的外泌体辅助肿瘤细胞产生的外泌体共同调控肿瘤细胞以及肿瘤的微环境，引起肿瘤免疫逃逸，影响肿瘤的形成、侵袭和转移[46]。

临床检测结果表明肿瘤浸润的Treg细胞可通过释放外泌体发挥免疫调节作用。Santos等[47]研究乳腺癌发现肿瘤干细胞以及Treg细胞分泌外泌体组分miR-155促进上皮细胞转化为上皮间质细胞而增加耐药性促进肿瘤复发；Huang等[48]实验发现表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)与肺癌的发生密切相关，EGFR能够活化PI3K引起DC表达IDO形成耐受性DC产生Treg细胞，Treg细胞及其产生的外泌体通过表面分子以及穿孔素和颗粒酶作为肿瘤特异抗原可以破坏肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞，促使肿瘤侵袭；Whiteside等[49]研究头颈部鳞癌发现外泌体包括Treg细胞来源的外泌体表达程序性细胞死亡蛋白配体-1(Programmed death ligand-1，PD-L1)，与PD-1结合后启动PI3K传递抑制信号，抑制CD4+T向Th1和Th17分化，以及抑制Teffs作用，促进肿瘤细胞发生上皮间质化而促进肿瘤的侵袭和转移。

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位经淋巴、血液或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程，超过95%的肿瘤相关死亡都由肿瘤转移引发，这一过程不是单一癌细胞的自主功能，而是需要多种因素共同形成肿瘤微环境来完成[50]。研究发现，在肿瘤转移过程中外泌体介导信号转导，其中肿瘤浸润Treg细胞来源的外泌体可以作为载体携带源细胞中的生物活性物质，通过内分泌循环辅助建立肿瘤微环境，介导营养转移、促进血管生成和凝聚以及癌细胞增殖转移等作用[51]。因此，肿瘤的微环境能够检测到大量的Treg细胞，Treg细胞产生的外泌体促进肿瘤局部微环境的建立与维持，为肿瘤的侵袭和转移提供帮助，而揭示Treg细胞产生的外泌体对肿瘤调节的作用机制，有利于将Treg细胞来源的外泌体作为肿瘤检测和治疗的手段[52,53]。研究Treg细胞来源的外泌体为炎症性疾病的早期诊断、预后及免疫治疗提供新的思路，作为基因干预治疗的新靶点，在临床上为肿瘤免疫治疗与诊断提供潜在手段。

5 结论与展望

Treg细胞可通过多种机制调控免疫应答，包括近距离细胞接触的方式比如利用其表面表达的分子或细胞毒作用；远距离Treg细胞分泌抑制因子或受体分子等方式抑制Teffs。近来研究发现Treg细胞可利用外泌体作为胞内信号交流的新机制来调控免疫应答，了解其作用机理有助于将Treg细胞来源的外泌体开发为抗肿瘤疫苗以及作为药物或生物工程载体准确靶向细胞用于疾病诊断与治疗，对其生物活检技术具有无限期望。

Treg细胞来源的外泌体用于人类疾病治疗具有有效性和安全性，但还存在一些关键限制，如目前还没有关于外泌体提取、分离和纯化的正式标准；Treg细胞非组成型释放外泌体，需要CD3+CD28+抗体激活，这样存在污染的可能；使用外泌体的特异靶向性和用量还不能确定等问题需进一步解决。因此，医学家和生物学家需共同深入阐明Treg细胞的免疫调节的分子机制以及利用Treg细胞来源外泌体开发稳定特异免疫疗法对有效治疗免疫相关疾病具有重要理论和临床实践意义。