Hdm2剪接体促进结直肠癌细胞增殖的分子机制

周锋 沙德胜 刘红

[摘要] 目的 探讨Hdm2剪接体促进结直肠癌细胞增殖的分子机制。 方法 该研究内容起止时间：2015年1月—2017年12月。构建Hdm2剪接体的稳转细胞株后进行CCK-8的检测，并利用western-blot相关下游蛋白的检测。结果Hdm2剪接体与对照组相比可以促进结肠癌细胞的增殖（P<0.05），p53和p21的表达明显下降（P<0.05），同时上调p-p38和p38的表達（P<0.05）。 结论 Hdm2剪切体与结肠癌细胞的增殖相关，其通过下调抑癌基因p53，p21的表达，激活p-p38和p38的表达促进结直肠癌的发生和发展。

[关键词] 结直肠癌；Hdm2剪切体；mRNA；p53

[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）10（c）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Hdm2 splice promoting proliferation of colorectal cancer cells. Methods The start and end time of this study： from January 2015 to December 2017. The stable cell line of Hdm2 splice was constructed and tested for CCK-8， and the detection of downstream proteins related to western-blot was used. Results Hdm2 splices promoted the proliferation of colon cancer cells compared with the control group（P<0.05）， and the expression of p53 and p21 decreased significantly （P<0.05）， expression of p-p38 and p38 （P<0.05）. Conclusion Hdm2 splicing is associated with the proliferation of colon cancer cells， which promotes the development and progression of colorectal cancer by down-regulating the expression of p53， p21 and activating p-p38 and p38.

[Key words] Colorectal cancer； Hdm2 splicing； mRNA； p53

结直肠癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，据最新统计资料显示，全球范围内，结直肠癌的发病率和死亡率在男性患者中列第3位（10.0%），在女性患者中列第2位（9.2%）[1]，并以每年超过100万例新增病例的速度递增，严重影响着人们的生命健康与生活质量。外界多种因素的作用导致正常上皮细胞遗传学或表观遗传学的改变，被认为是导致结直肠癌的主要原因，进一步基因突变和微环境改变加剧了结直肠癌的恶性程度。因此，深入研究结直肠癌发生发展的分子机制对明确其致病机理、早期诊断及临床治疗有重要意义。

Hdm2 是公认的致癌基因，位于人类基因染色体12q13-14，可以降解p53蛋白导致其抑癌功能失去[2-4]。早期关于Hdm2的研究发现，其mRNA具有多种剪接方式，在肿瘤的细胞系中颇为常见。异常剪接会造成基因转录的中段，其原因为成熟的mRNA中的外显子丢失，或者不可避免地将无义密码子引入而改变了读码框。其中Hdm2最常见的一种剪切形式是缺失第四，第五，第六外显子，截短的Hdm2蛋白产物仅包含p53结合域[5-7]。在细胞受到遗传毒性和致癌毒性后，Hdm2 mRNA剪切形式发生变化。然而Hdm2的选择性剪切的原因及造成的结果并不清楚。前期研究发现Hdm2的10号外显子和11号外显子在DNA损伤时会插入一段108bp序列（见图1）。插入的片段还有终止密码子，导致了11号和12号外显子的缺失。然而这两个外显子导致的结果并不是很清楚。该研究于2015年1月—2017年12月构建了Hdm2的插入108bp片段（Hdm2-S）的过表达慢病毒，研究阐明了这种选择性剪接在结直肠癌细胞中的功能及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞 人结肠癌野生型细胞株SW1116，Caco-2，HT29，Hct116和293T购于中国科学院上海细胞所。

1.1.2 实验试剂 高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒、PMSF、SYBR green荧光染料、Taq酶，聚丙烯酰胺预制梯度凝胶等购于Invitrogen公司；DNA 限制性内切酶，T4连接酶购自NEB公司；实验用蛋白检测抗体均购于CST公司。

1.1.3 仪器设备 分子生化实验设备：高速离心机、台式离心机、三联式水浴锅、移液枪、PCR扩增仪、电子天平、pH酸碱值测定仪、BIO-RAD电泳仪、BIO-RAD垂直电泳槽、水平电泳槽、Tanon紫外凝胶成像仪、Odyess荧光扫描仪、生物通风柜、水平摇摆仪、恒温培养箱、高压锅。

细胞培养设备：生物安全柜、电动移液器、恒温水浴锅、低温冰箱、超低温冷柜、台式低速离心机、振荡仪、Olympus倒置式荧光纤维镜、细胞培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将细胞株SW1116和293T分别培养于含10% FBS的DMEM培养基中，下传代至对数生长期后进行试验。SW1116细胞建立的稳转细胞株，培养条件不变。以上培养均在37℃、5% CO2的培养箱培养。

1.2.2 构建质粒与转染 构建Myc或Flag标签的Hdm2和Hdm2-S质粒。质粒克隆均以细胞cDNA作为模板，利用高保真Pfu DNA 聚合酶（Agilent， Ultra II）进行PCR，使用的内切酶购于NEB公司。自行构建质粒克隆引物如下。

Myc-Hdm2：

F（BamH1）：5'-CGGGATCCCGATGGAACAGAAAC TGATCTCTGAAGAAGACCTGATGTGCAATACCAACAT GTCT GTACCTACTG-3'

R（EcoR1）：5'-CCGGAATTCCGGCTAGGGGAAATA AG TTAGCACAATC-3'

Flag- Hdm2-S

F（BamH1）：5'-CGGGATCCCGATGGAGCGGTTAGGAGAGAA-3'

R（EcoR1）：5'-CCGGAATTCTCAGTTATAGAATGAT TTCT-3'

SW1116细胞长到80%～90%时，利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行细胞转染实验。首先取Opti-MEM（Gibco）500 μL放入1.5 mL离心管，随后加入质粒和Lipofectamine2 000，比例为1：3，每转染1 μg质粒，加入3 μL 的Lipofectamine2 000，混匀后室温放置30 min后，加入SW1116细胞中。利用完全培养基（DMEM+10%血清+双抗）补足。24 h后更换完全培养基（DMEM+10%血清+双抗）。

1.2.3 慢病毒包装及稳转结肠癌细胞系的建立 慢病毒的包装：10 cm培养皿培育293T细胞，细胞密度达到90%后，利用LIP2000进行质粒（病毒载体质粒5 μg，相应的包装质粒各2.5 μg）转染，脂质体和质粒的比例为1∶3。混合6 h后更换新鲜培养基8 mL，待48 h后收集病毒上清，利用0.22 μm的滤膜过滤后， -80℃保存。

感染结肠癌细胞株：当结肠癌细胞密度达到80%满盘时，取5 mL病毒上清加入细胞培养皿中，为了增加感染效率同时加入终浓度为5 μg/mL的polybrene，感染24 h后，更换含有10%的胎牛血清的培养基。随后加入终浓度3 μg/mL的嘌呤霉素进行阳性细胞的药筛。随后通过基因水平及蛋白水平检测鉴定稳转细胞株。

1.2.4 Real-Time PCR检测目的基因表达 根据NCBI提供的Hdm2（NM_002392.5）和Hdm2-S （NM_0011453 40.2）的mRNA序列设计检测引物。随后利用TRZOL试剂提取稳转细胞的总RNA，利用cDNA合成第一链试剂盒逆转录cDNA。空载病毒质粒的SW1116细胞作为对照，β-actin作为PCR的内参。使用美国ABI公司FAST7500型荧光定量PCR仪，加入SYBR荧光染料，进行Real-Time PCR。PCR反应条件：95℃ 5 min预变性， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s共进行40个循环，以2-ΔΔCT值评估相对表达量。每组实验设置3个复孔。

1.2.5 细胞活性检测（Cell Counting Kit-8， CCK-8） CCK-8检测试剂盒购自日本DOJINDO公司。将实验组及对照组细胞分别接种到96孔板中，每孔100 μL，大约105细胞。放在细胞培养箱培养（在37℃，5%CO2）。检测时每孔加入10 μL的CCK-8溶液，放置2 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.6 统计方法 用2-△△ct法处理实时荧光定量RT-PCR所得的ct数据，采用SPSS 15.0统计学软件处理获得的数据，由于实验组标本2-△△ct值不符合正态分布，以2个独立样本检验进行统计分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测Hdm2和Hdm2-S在结肠癌中的表达

利用PCR分别检测Hdm2和Hdm2-S在结肠癌细胞株HCT116，SW1116，Caco-2和HT29的表达。结果显示，Hdm2在SW1116和HCT116中表达最低，而在Caco-2和HT29的表达高。Hdm2-S在SW1116中表达最低，而在HCT116，Caco-2和HT29的表达高。综合以上结果，选取了SW1116进行下一步研究。以上实验差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.2 构建Hdm2和Hdm2-S在SW1116结肠癌中的稳转细胞株

转染带有标签的慢病毒Lenti-myc- Hdm2和Lenti-flag-Hdm2-S构建Hdm2和Hdm2-S过表达Sw1116细胞株，与对照组相比，Hdm2和Hdm2-S的mRNA水平显著升高（圖3A）。Hdm2和Hdm2-S的蛋白表达水平也有表达（图3B），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 Hdm2和Hdm2-S对结肠癌细胞增殖能力的影响

利用CCK-8实验研究过表达Hdm2和Hdm2-S对结肠癌细胞株增殖能力的影响。研究发现48 h之前没有显著性差异，在48 h以后Hdm2-S增殖能力强于Hdm2，而Hdm2增殖能力显著强于对照组。差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

2.4 Hdm2和Hdm2-S 对结肠癌细胞p53，p21，p38和p-p38表达水平的影响

利用Western-blot检测过表达Hdm2和Hdm2-S和对照组的p53，p21，p38和 p-p38的蛋白表达水平变化。与对照组相比Hdm2和Hdm2-S在SW1116细胞中p53蛋白水平明显降低，尤其Hdm2-S差异更明显。与对照组相比Hdm2和Hdm2-S在SW1116细胞中p21蛋白水平明显降低，尤其Hdm2-S差异更明显。与对照组相比Hdm2和Hdm2-S在SW1116细胞中p38和P-p38蛋白水平明显升高，其中Hdm2-S的P-p38表达最高。以上实验差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

3 討论

结直肠癌是发病率在全球癌症中位居第三位，致死率在全球癌症中位居第四位[1]。研究发现基因的选择性剪切与肿瘤的发生和发展密切相关。Hdm2是一个癌基因，由12个外显子构成，第1号和第2号外显子是调节翻译速率的非编码区，第3～12号外显子包含编码序列。其功能主要通过泛素化降解抑癌基因P53蛋白[5，8-9]。Hdm2在多个肿瘤中过度表达，其表达上调被认为是p53失活的主要原因。然而目前很多研究发现Hdm2的功能不仅与p53的降解相关，它本身mRNA的选择性剪切与肿瘤的发生和发展密切相关[10-11]。目前研究发现在遗传毒性作用下，Hdm2的选择性剪切会发生改变，产生新的剪切体，而某些形式的高表达可能具有致癌性质。目前报道有5种Hdm2剪接子，主要包括Hdm2WT；Hdm2 Δ6；Hdm2 Δ3-6；Hdm2 Δ6-9和 Hdm2 Δ4-9[6， 12，-13]。按照功能分为两种，一种是含有p53结构域，例如：Hdm2WT；Hdm2 Δ6和Hdm2 Δ6-9；另一种是含C末端RING结构域，如：Hdm2 Δ3-6和Hdm2 Δ4-9。Hdm2 Δ6在软组织肉瘤、乳头状甲状腺瘤中高表达，并且与不良预后有关[14]。Hdm2 Δ6与p53紧密结合，其结合作用比Hdm2WT更强，可以抑制p53介导的转录活性并抑制细胞凋亡。与Hdm2 Δ6相似，其缺失造成终止密码子提前出现，Hdm2 Δ4-9仅保留了p53结合区域，其与p53结合能力更强。Hdm2 Δ4-9表现为p53结合区域的缺失，它通过结合Hdm2抑制p53的降解从而稳定p53功能[15]。

该次的研究发现Hdm2-S是在10号外显子后插入了一段108bp的片段，其中包含有终止密码子。不同于之前的报道，由于Hdm2-S缺失了第10号和第11号外显子，即缺失了C末端RING结构域。然而让我们困惑的是在Hdm2-S过表达细胞中，p53的表达与对照组相比明显降低，并且其下游蛋白p21表达显著降低，关于为何Hdm2-S可以减少p53的表达将进一步研究。同时利用CCK-8研究发现Hdm2-S过表达组可以促进SW1116的增殖，并且与Hdm2过表达组相比有显著增强，这个研究与抑癌基因P53和P21的抑制结直肠癌细胞增殖相一致[16]。p38及p-p38的激活和结肠癌的增殖密切相关[17]，于是进一步检测了p38及p-p38的表达，研究发现Hdm2-S组明显可以激活p-p38和p38，这也初步解释了Hdm2-S促进结直肠癌增殖的分子机制。该研究阐明了Hdm2-S剪切体在结直肠癌细胞中的作用，为治疗结直肠癌提供了新的靶点，进而为Hdm2选择性剪切的功能提供了新的理论和实验依据。

[参考文献]

[1] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[2] Individualized prediction of perineural night in colorectal cancer： development and validation of a radiomics prediction model[J].Journal of cancer research in China （English editio n），2018，9（1）：40-50.

[3] Pathologic response after preoperative therapy predicts progn osis of Chinese colorectal cancer patients with liver metasta ses[J].Cancer （English edition），2017，3（11）：537.

[4] Wachter F，Morgan AM，Godes M，et al.Mechanistic validation of a clinical lead stapled peptide that reactivates p53 by dual HDM2 and HDMX targeting[J].Oncogene，2017，36（15）：2184-2190.

[5] Synthetic lethal short hairpin RNA screening reveals that ring finger protein 183 confers to hold to trametinib in colorectal cancer cells[J].Cancer （English edition），2017，8（12）： 726.

[6] Knockdown of GRHL3 Inhibits Activities and Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis of Human Colorectal Cancer Cells [J].Journal of huazhong university of science and technology （medical English German），2017，4（6）：880.

[7] Spatio - temporal analysis of the incidence of colorectal cancer in through，2010-2014[J].Cancer （English edition），2017，2 （10）：516.

[8] Liu N，Zhang J，Yang X，et al.HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function[J].J Virol，2017，91（16）：JVI.00340-17.

[9] Liu S，Tackmann NR，Yang J，et al.Disruption of the RP-MDM2-p53 pathway accelerates APC loss-induced colorec tal tumorigenesis[J].Oncogene，2017，36（10）：1374-1383.

[10] An T，Gong Y，Li X，et al.USP7 inhibitor P5091 inhibits Wnt signaling and colorectal tumor growth[J].Biochem Pharm- acol，2017，131：29-39.

[11] Yu Z，Zhang B，Cui B，et al.Identification of spliced variants of the proto-oncogene HDM2 in colorectal cancer[J].Cancer，2012，118（4）：1110-1118.

[12] Clinicopathologic features and treatment efficacy of Chinese patients with BRAF - mutated metastatic colorectal cancer： a retrospective observational study[J].Cancer （English editi- on），2017，13（11） ： 626-634.

[13] A retrospective analysis of the safety and efficacy of apatinib in treating advanced metastatic colorectal cancer[J].Journal of oncology and translational medicine （in English），2017，9（5）：210.

[14] Soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells - 1 and Inflammatory Markers in Colorectal Cancer Surgery： A Prospective Cohort Study[J].Journal of the Chinese medi- cal journal （English edition），2017，13（22）：2691.

[15] Inoue K，Fry EA，Frazier DP.Transcription factors that interact with p53 and Mdm2[J].Int J Cancer，2016，138（7）：1577-1585.

[16] Luo Z，Zheng K，Fan Q，et al.Hyperthermia exposure induces apoptosis and inhibits proliferation in HCT116 cells by upregulating miR-34a and causing transcriptional activation of p53[J].Exp Ther Med，2017，14（6）：5379-5386.

[17] Shen LT，Chou HE，Kato M.TIF1β is phosphorylated at serine 473 in colorectal tumor cells through p38 mitogen-activated protein kinase as an oxidative defense mechanism[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，492（3）：310-315.

（收稿日期：2018-07-21）