APP下载

Klotho基因转染BMSC移植对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响

2018-01-24朱向情李慧萍甘世保李丽娟潘兴华

西南国防医药 2018年1期
关键词:心肌细胞心衰纤维化

王 欢,朱向情,李慧萍,尹 娜,甘世保,杨 静,李丽娟,潘兴华,魏 玲

心肌细胞凋亡是心肌重构的主要病理基础,它在心衰、心律失常等多种心脏疾病的病理生理中起着重要作用。本课题组前期研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSC)在心肌微环境下,能向心肌细胞、浦肯野细胞及内皮细胞分化,并分泌各种细胞因子,抑制心肌细胞凋亡,促进心肌细胞生长,减少基质胶原沉积,减轻心肌纤维化[1]。Klotho基因是1997年Kuro等研究自发性高血压大鼠时偶然发现的新型抗衰老基因,具有抗氧化应激、减少炎症反应、抑制心肌细胞及血管内皮细胞凋亡、改善心肌微环境等作用[2]。本研究将重组慢病毒介导的Klotho基因转染至BMSC,并移植到慢性心衰大鼠心肌中,探讨Klotho基因修饰的BMSC移植对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠24只,其中 18 只鼠龄约 3 月龄,体重(300±30)g,用于心衰大鼠模型制备,另外6只为正常组;另有6只1月龄大鼠,体重(100±20)g,用于制备 BMSC。所用动物均由昆明医科大学动物实验中心提供[动物许可证号:SCXK(滇)2011-0005]。置动物房适应性喂养1 w,自由摄食及饮水,实验前12 h禁食。

1.2 试剂与仪器 DMEM-F12细胞培养基(北京HyClone 公司),胎牛血清(FBS,美国 BI公司),胰蛋白酶-EDTA消化液、青-链霉素抗生素(北京Solarbio公司),SD大鼠BMSC成骨、成脂诱导分化培养基(广州赛业生物科技有限公司);盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司),Masson染色试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司),慢病毒载体LVEGFP-Klotho基因,LV-EGFP基因(上海吉凯生物有限公司)。

1.3 BMSC的分离培养及Klotho基因转染 取1月龄大鼠,按本课题组另文报道的方法制备、鉴定BMSC。取第 3代 BMSC,以 5×105个细胞/孔铺板于48孔板,至细胞覆盖率达70%时,按预先测的最佳感染复数(MOI值)150计算并加入慢病毒LV-EGFP、LVKlotho病毒液,进行慢病毒LV-EGFP-Klotho基因转染BMSC。取病毒转染1 w后的BMSC,同时以未转染BMSC及EGFP-BMSC为对照。用Trizol法提取总RNA,测定RNA浓度,按照反转录试剂盒说明书,取1 μg RNA反转录获得cDNA,并以cDNA为模板,扩增目的基因片段。PCR引物由上海生工生物有限公司合成。大鼠Klotho引物:上游CAATGG CTTCCCTCCTTTACCT,下游 TTCTCTTCTTGGCTAC AACCCC,内参GAPDH引物:上游5'TTCCTACCCC CAATGTATCCG3',下游 5'CATGAGGTCCACCACCC TGTT3'。PCR反应条件为预变性95℃、10 min,再一步变性95℃、15 s,退火延伸60℃、60 s,共40个循环。PCR结束后,根据每个样本反应后达到荧光信号阈值的循环数(Ct值)计算 2-△△Ct值。

1.4 大鼠心衰模型制备及分组 实验大鼠腹腔给予异丙肾上腺素注射,3 mg/(kg·d),共 14 d,建立慢性心衰大鼠模型。随机将18只慢性心衰模型大鼠分为Klotho-BMSC、BMSC、模型组,同时设正常组,每组6只。Klotho-BMSC组和BMSC组分别经尾静脉注射携带Klotho基因的EGFP基因标记BMSC(EGFP-Klotho-BMSC)和仅EGFP基因标记的BMSC(EGFP-BMSC)5×106个/ml,1 ml/只;模型组经尾静脉注射等量生理盐水,正常组不做处理,

1.5 大鼠心肌细胞凋亡检测 BMSC治疗后28 d,取各组大鼠心肌组织,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、连续切片,切片厚度为 5 μm,进行 TUNEL染色。另取各组大鼠心肌组织标本进行OCT包埋及冰冻切片(15 μm),在倒置荧光显微镜下观察转染EGFP的BMSC存活及分布情况。

1.6 统计学方法 应用SPSS18.0软件分析数据,计量资料以均数±标准差表示,多个样本均数间的比较采用方差分析和LSD-t检验;两变量相关性采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSC形态观察 BMSC分离培养48 h后,可见短小梭形、三角形的BMSC贴壁生长;4 d后集落形成,细胞体积增大,多呈长梭形;原代细胞10 d左右达90%以上融合,为均一呈漩涡状排列的长梭形细胞群。传代后细胞增殖时间缩短,形态为成纤维样,平均4 d达85%以上融合。见图1。

2.2 转染Klotho后各组Klotho mRNA表达量比较RT-PCR检测结果显示,模型组、BMSC组、Klotho-BMSC组的Klotho mRNA相对表达量分别为0.4256±0.4464、0.4185±0.4251 和 1.000±0.7076,Klotho-BMS 组显著高于其他两组(P<0.05)。

2.3 Klotho-BMSC治疗4 w后各组心肌组织绿色荧光分布 荧光显微镜下可见,Klotho-BMSC组和BMSC组有EGFP标记的BMSC在心肌组织中分布,并且Klotho-BMSC组明显多于单纯BMSC组,而模型组和正常组未见EGFP阳性细胞分布(图2)。

2.4 各组心肌Klotho mRNA表达水平比较 各组大鼠心肌组织中均有Klotho基因表达(图3)。正常组、模型组、BMSC组、Klotho-BMSC组心肌组织中Klotho基因的mRNA相对表达量分别为1.803±0.530、0.782±0.145、1.207±0.214、4.857±0.597。 Klotho-BMSC组的Klotho mRNA表达水平较模型组、BMSC组高(P<0.01),BMSC组与模型组之间无显著差异(P > 0.05)。

2.5 Klotho-BMSC治疗4 w后各组心肌细胞凋亡率比较 正常组心肌细胞凋亡数量很少;腹腔注射ISO后,心肌细胞凋亡率增加,BMSC组为(23.55±3.62)%、Klotho-BMSC 组为(12.61±2.00)%、模型组为(43.61±4.88)%,较正常组(1.53±0.69)%显著升高(P< 0.01)。 而 Klotho-BMSC 组、BMSC 组低于模型(P<0.01),以Klotho-BMSC组降低最明显(P< 0.01)。

2.6 心肌细胞凋亡率与心肌组织Klotho mRNA的相关性分析 各组心肌组织Klotho mRNA的表达量及心肌细胞凋亡率均呈正态分布。Pearson相关分析结果显示,心肌Klotho mRNA表达量与心肌细胞凋亡率呈显著负相关(r=-0.598,P<0.05)。

3 讨论

图1 BMSC培养形态观察

心肌细胞凋亡是心肌重构期心肌收缩单元不断丧失的主要原因[6]。研究显示,心肌细胞凋亡后,其自我修复能力是极其有限的,不足以弥补心肌细胞数的减少及维持心肌损伤的修复,其对早期及晚期心肌重构乃至心衰的产生和恶化均有促发作用[7]。BMSC具有自我更新及高度增殖能力,能自体移植,能向多种组织分化,并且具有修复受损组织的潜能[3]。王永等[3]研究发现,BMSC移植能改善犬急性心肌梗死后心肌纤维化,其心肌间质胶原含量随着时间呈减少趋势。徐燕等[4]研究证明,BMSC能治疗扩张型心肌病大鼠,细胞移植4 w后,大鼠心功能明显改善,心肌胶原含量减少,心肌MMP-2及MMP-9的表达降低,心肌纤维化明显改善。本研究与上述实验结果类似,也发现BMSC移植治疗慢性心衰大鼠4 w后,大鼠心肌细胞变性坏死程度较模型组明显减少,提示BMSC具有抗慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的作用。

图2 EGFP标记的大鼠BMSC在心衰大鼠心肌内的分布情况

图3 心肌组织中Klotho mRNA表达水平的实时定量PCR检测结果

Klotho基因具有抑制血管紧张素Ⅱ诱导活性氧族产生、抑制细胞衰老及凋亡、抗炎症反应、维持内皮细胞完整性、促进NO的产生、改善动脉顺应性、改善心肌重构及纤维化等作用[5-6]。本实验将Klotho基因转染至EGFP基因标记的BMSC,并成功移植到慢性心衰大鼠心肌中,荧光显微镜下可见,Klotho基因修饰后的BMSC在心肌组织中的存活率明显增加,而心肌细胞凋亡率进一步降低。本研究结果提示,BMSC本身具有抑制心衰大鼠心肌细胞凋亡、纤维化的功能,Klotho基因修饰BMSC移植治疗慢性心衰大鼠,可显著提高BMSC在心肌组织中的存活率,使其抑制心肌细胞凋亡的作用更加显著。

[1] Takuy a Narita,Ken Suzuki,etal.Bonemarrow derived mesenchymal stem cells for the treatment of heart failure[J].Heart Fail Rev,2015,20(1):53-68.

[2] Ikushima M,Rakugih I,Shikawa K,et al.Anti-apoptotic and anti-senescence effects of klotho on vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,339(3):827-832.

[3] 王永,范家伟,方五旺.犬自体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后胶原纤维含量影响的实验研究[J].医学综述,2010,16(23):3656-3659.

[4] 徐燕,张瑶,李丽丽.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠扩张型心肌病[J].中国组织工程研究,2012,16(14):2576-2580.

[5] Semba RD,Cappola AR,Sun K,et al.Plasma Klotho and cardiovascular disease in adults [J].Am Geriatr Soc,2011,59(9):1596-1601.

[6] Six I,Okazaki H,Gross P,et al.Direct acute effects of Klotho and FGF23 on vascular smooth muscle and endothelium[J].PLoS One.2014,9(4):e93423-e93423.

猜你喜欢

心肌细胞心衰纤维化
肝纤维化无创诊断研究进展
国外心衰患者二元关系的研究进展
左归降糖舒心方对糖尿病心肌病MKR鼠心肌细胞损伤和凋亡的影响
睡眠质量与心衰风险密切相关
活血解毒方对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响
讨论每天短时连续透析治疗慢性肾脏病合并心衰
冠心舒通胶囊对心肌细胞Ca2+ -CaM-CaMPK Ⅱ δ信号系统的影响
新纤维化相关因子SFTPA2在梗阻性肾组织中表达及与肾纤维化之间关系的研究
槲皮素通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大
肾纤维化的研究进展