山羊胎肝内定位注射不同体积间充质干细胞对胎羊发育的影响

黄小昆，龙 海，苏锡雄，杨艾梅，李自安，余 璞，王 强，刘菊芬，王金祥，潘兴华，庞荣清，许立奇

宫内干细胞移植（inuterostemcelltransplantation）是建立嵌合体模型的有效方法，比如Flake等[1]和黄淑帧等[2]课题组就采用B超引导下胎羊腹腔内注射人造血干细胞的方法成功建立了人-羊嵌合体模型，并证实移植的人源细胞可在嵌合体动物肝脏等多个组织器官中广泛存在[3]。如果采用宫内干细胞移植的方法将干细胞直接注射到胎羊肝脏，理论上来说将非常有利于嵌合体肝脏的形成。因此，本研究探索B超引导下定位注射干细胞到山羊胎肝的技术方法，为通过宫内干细胞移植途径建立嵌合体模型并开展相关实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、材料和仪器 DMEM/F-12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清和0.25%胰蛋白酶（均为BI公司）；倒置荧光相差显微镜（NIKON公司）、荧光显微镜（Lwica DMI3000B）、流式细胞仪（BD 公司）；超声波穿刺针（CREATE MEDIC株式会社）；B型超声多普勒（PHILIPSIU22）。

1.2 实验动物 1月龄雄性云南乌骨山羊1只，疑似怀孕1.5～3个月的云南乌骨母山羊10只，均来源于云南农业大学。

1.3 实验方法

1.3.1 山羊骨髓间充质干细胞制备 于1月龄雄性山羊髂骨后棘处无菌穿刺针采集1～2 ml肝素抗凝骨髓。参照课题组建立的分离培养方法分离间充质干细胞[4]，即在无菌条件下，以1000 r/min离心3 min,漂洗后用含10%胎牛血清的DMEMF12培养液重悬骨髓细胞，转移至培养瓶中于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内静置培养，适时换液并传代。

1.3.2 怀孕山羊的鉴定 疑似怀孕母羊10只，禁食禁水12 h，腹部备皮后固定于实验台上，B超探查确定胎儿的存在，观察胎儿数量、胎儿性别和发育状况。

1.3.3 超声引导下山羊胎肝穿刺和定位注射 在母羊怀孕约3个月时，将超声探头置于怀孕山羊腹部，确定胎羊位置及穿刺点，然后利多卡因局部浸润麻醉预穿刺点，调整超声探头角度，固定消毒后的固定架于超声探头，将无菌穿刺针置于固定架穿刺孔，小心刺入母羊腹壁并进入胎肝，拔出针芯连接备有细胞的注射器，注射细胞后拔出穿刺针，压迫止血。注射完毕，将母羊置于圈舍精心饲养，观察胎羊出生与流产情况。注射方案见表1。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞制备 采用髂骨后棘穿刺法可一次性获得骨髓至少0.5 ml，采用全骨髓培养法，即采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液悬浮细胞并静置培养的方法，可以在10 d内观察到很多长梭状贴壁生长的细胞（图1A），传代后可获得密集排列呈旋涡状生长的细胞（图1B）。传代5代即可获得满足实验需要量，用生理盐水悬浮细胞并调整浓度为2.1×107cell/ml的悬液备用。

图1 山羊骨髓间充质干细胞（4×10）

2.2 怀孕山羊的准备 借助B超，可以清晰观察到怀孕1.5～3个月的母羊腹腔脏器分布和胸腔轮廓清晰的胎羊，并可观察到明显的胎心收缩和舒张以及动态血流影像甚至胎动（图2A），可监听到节律整齐的心音（图2B）。10只交配后疑似怀孕1.5～3个月的母羊中有6只怀孕，其中，5只怀有1胎，1只怀有2胎，7只胎羊性别为雌性4只，雄性3只。

2.3 胎肝内定位注射 在B超显像下，可清晰观察到胎心节律性跳动，以此可确定位于胎心旁的胎肝位置，通过观察肝脏形态及血流动态即可准确识别并确定胎肝的位置（图3A）。调整超声探头及固定架的角度确保穿刺针进针方向正确之后，通过超声动态现象可以清晰显示进针位置（图3B），避开血管，观察推入少许气泡后白色亮点的存在和位置（图3C），即可准确定位穿刺针针尖的位置处于胎肝实质区域。连接备有间充质干细胞悬液的注射器，即可将1 ml或4 ml的间充质干细胞悬液准确注入胎肝实质区域。

2.4 怀孕母羊的观察与流产 胎羊肝脏接受定位注射生理盐水悬浮的雄性山羊骨髓间充质干细胞悬液后得到结果见表1，其中A组2只肝脏注射了1ml（含2.1×107个细胞）的雌性胎羊顺利出生，其中之一为双胞胎的雌性胎羊接受注射而另一只雄性胎羊没有注射均顺利出生。B组注射了相同容积但4倍数量的细胞的胎羊也顺利出生，这4只母羊穿刺后饮食正常，精神状态良好，最终顺利产下了5只发育良好的羊羔。C组2只怀孕母羊的胎肝内注射了4倍容积但与B组相同数量的细胞，3 d后母羊精神萎靡嗜睡，分别于穿刺后第8天和第10 d发生流产，产下了死胎，母羊存活。

3 讨论

图2 怀孕母羊诊断的超声影像图

图3 胎肝内定位注射超声影像图

表1 超声引导下不同注射方案和产羔结果

B超显像不但能够获得组织器官的解剖图，显示器官的外形、内部回声，而且还可以显示动态脏器的结构和功能[5]，也可用于对妊娠期产妇甚至产时进行胎心监护，及时发现胎儿生理发育状况[6-7]。本研究结果显示，1.5个月以上的胎羊均可在B超显像条件下清晰地观察到胎心的跳动和心音、显示胎肝位置及肝脏血流动态位置。宫内干细胞移植是建立嵌合体模型的有效方法，借助B超，可以准确诊断怀孕1.5个月以上母羊怀的是单胎还是双胎及胎羊性别，并可准确定位所需穿刺点。怀孕单胎山羊适于精确定位注射建立嵌合体模型，怀孕双胎山羊适于开展干细胞迁移与分化的实验研究，胎羊性别的确定有助于进行性别错配设计便于嵌合体鉴定分析。

云南乌骨山羊性情温顺，通常怀有单胎，孕期5个月，体型中等，腹壁皮下脂肪少，便于开展嵌合体研究。本研究显示：在B超引导下可以准确确定1.5月龄以上胎羊肝脏位置并准确穿刺注射BMSC细胞悬液到胎肝实质区域。注射1 ml细胞悬液的条件下，BMSC数量增加4倍不会导致胎羊流产，但BMSC数量不变，注射4 ml体积的细胞悬液则100%（2/2）导致流产，这说明发育过程中的乌骨山羊胚胎可以接受大量同种MSC但不能接受大容积的细胞悬液，这可能与注射过多体积的生理盐水细胞悬液进入胎肝、改变了胚胎发育的内环境有关。超声引导下将间充质干细胞移植到胎肝内，是一种无需手术的定位穿刺移植方法，可多次注射，是制备嵌合体肝脏的理想技术方案。本研究为嵌合体肝脏制备及肝病的发病机制、药物代谢以及干细胞体内分化的研究提供了模型基础。

[1] Flake AW,Harrison MR,Adzick NS,et al.Transplantation of fetalhematopoietic stem cells in utero:the creation of hematopoietic chimeras[J].Science,1986,233(4765):776-778.

[2] Zeng F,Chen M,Katsumata M,et al.Identification and characterization ofengrafted human cells in human/goat xenogeneic transplantation chimerism[J].DNA Cell Biol,2005,24(7):403-409.

[3] Qian H,Wang J,Wang S,et al.In utero transplantation of human hematopoietic stem/progenitorcellspartially repairs injured liver in mice[J].Int J Mol Med,2006,18(4):633-642.

[4] 庞荣清，何洁，李瑞生，等.食蟹猴脐带间充质干细胞的分离与鉴定[J].中国比较医学杂志，2015，25（4）：66-69.

[5] 谭静,刘军,张文军,等.多普勒超声评价晚孕和临产前脐带绕颈胎儿大脑中动脉血流动力学与围生儿临床结局[J].四川医学,2015,36(11):1514-1517.

[6] 张文文.胎儿宫内窘迫 541例剖宫产指征分析[J].中国实用医药,2015,10(34):89-90.

[7] 谢学萍,邓捷.产时胎心监护的临床效果观察及护理[J].齐齐哈尔医学院学报,2015,36(28):4353-4354.