BMSC治疗ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型的初步研究
2018-01-24白盈盈刘菊芬张建平和法莲陈慧芬张梦圆王颖翠潘兴华刘高米洋
白盈盈,刘菊芬,张建平,和法莲,陈慧芬,张梦圆,王颖翠,潘兴华,刘高米洋
动脉粥样硬化(AS)是冠心病、心肌梗死、脑栓塞、血栓栓塞性疾病等多种缺血缺氧性心脑血管疾病的重要病理生理基础,严重危害人类健康,是人类死亡的主要原因[1]。随着人们生活水平和生活方式的改变,加之AS发病机制尚未完全清楚,无法确定有效的临床治疗方法,AS发病率逐渐上升,且年轻化,急需开拓新的治疗方法。间充质干细胞(MSC)移植治疗是近年新兴起的一种全新的治疗手段,研究发现,MSC可分化成内皮细胞、释放多种因子,且本身免疫原性较低,在AS的发生、发展中具有一定作用,为AS的治疗提供了新的思路。本研究旨在观察BMSC对ApoE-/-缺陷小鼠动脉粥样硬化模型的治疗效果,为BMSC治疗AS提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与器材 DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国 BI公司),双抗(美国BI公司),百万层级层流超净工作台(SW-CL-2F型,苏州佳宝净化工程设备有限公司),细胞培养孵箱(美国 Thermo公司),PCR 仪(Bio-rad公司)。
1.2 实验动物及分组 6 w龄ApoE-/-缺陷小鼠(品系C57BL/6)和C57BL/6小鼠均购自南京君科生物科技有限公司[合格证号:SCXK(军)2012-007],用于制备BMSC的6 w龄C57荧光小鼠为本实验室提供。所有实验用小鼠均在SPF级环境饲养,其中ApoE-/-小鼠从6 w龄开始给予高脂饲料,其余普通饲料喂养。C57BL/6 小鼠为正常对照组(n=8),ApoE-/-缺陷小鼠随机分为空白对照组(n=8)、阴性对照组(n=4)和实验组(n=4)。实验组从第9 w开始经尾静脉注射 1 ×105BMSC 200 μl,1 次/w,共注射 8 次;正常对照组和空白对照组不做处理,于12 w时2组分别处死4只进行模型鉴定;阴性对照组给予注射等体积生理盐水。BMSC注射4 w后即21 w时,剩余小鼠同时处死、采血、取材。
1.3 BMSC细胞分离与培养 取C57荧光小鼠脱颈处死,无菌取胫骨和股骨骨髓,用培养基稀释后接种于10 cm2塑料培养皿中,置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。72 h后首次全量换液去除未贴壁细胞,继续培养至 90%融合时,常规传代培养至第3代,收集细胞,进行细胞计数,配制成1×105细胞/200μ l的细胞悬液。
1.4 AS模型鉴定及疗效评价 空白对照组和正常对照组小鼠于12 w龄时进行基因型鉴定、血脂分析和主动脉弓斑块形成鉴定,实验组和阴性对照组于BMSC注射后4w时进行疗效评价。具体方法是:(1)基因型鉴定:剪取3~5 mm鼠尾,加入鼠尾裂解液裂解,提取DNA;PCR扩增,引物由昆明硕擎生物科技有限公司合成,上游引物:5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3',下游引物: 5-'TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'( ApoE 野生型),5-'GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'(ApoE突变型)。 PCR 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,通过电泳条带判断是否为ApoE缺陷小鼠。(2)血脂分析:小鼠双侧内眦静脉采血,用自动生化分析仪测定 TC、TG、HDL-C和LDL-C。(3)斑块形成鉴定:采用主动脉弓油红O染色法。脱臼法处死阴性对照组小鼠,分离主动脉弓,纵向剖开,4%多聚甲醛4℃固定过夜,用1×PBS冲洗2次,加入油红O染料工作液(油红O储存液:蒸馏水=3∶2,混匀后用中性滤纸过滤)4℃过夜,75%乙醇漂洗3次,5 min/次。 倒置显微镜下观察粥样斑块的数量、面积。
1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ApoE缺陷AS模型鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果显示,空白对照组小鼠PCR产物均仅有245 bp的条带,均为 APOE 突变型小鼠(图 2a)。 TC、TG、LDLC检测结果显示,空白对照组以上指标较正常对照组明显升高(P<0.05,表1)。空白对照组可见Apoe-/-小鼠动脉内壁有红色脂肪性斑块形成,粘附在血管壁上(图2b),正常对照组无红色斑块样结构。结果表明ApoE-/-小鼠高脂饮食至12 w时出现AS的典型特征,即血脂水平升高,动脉出现不规则斑块。
图2 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型鉴定
2.2 血脂水平比较 实验组TC、TG、LDL-C较阴性对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05),HDL-C各组相比差异无统计学意义(P>0.05),结果见表1。油红O染色显示,实验组斑块较阴性对照组面积、数量均有一定程度的减少(图3),但未达到正常对照组(图2c)效果,提示BMSC对AS有一定的治疗效果。
图3 BMSC抑制AS模型小鼠主动脉弓斑块形成
3 讨论
目前,国内外关于AS的发病机制有脂质浸润学说、血管平滑肌细胞克隆学说、氧化应激学说、免疫功能异常学说、炎症学说等[2]。研究显示,血管壁内皮损伤是引起AS的首要因素,同时炎症反应参与了AS的发生、发展[3]。此外,血管中膜平滑肌细胞受到各种病理刺激可迁移进入内膜,然后聚集、增殖为AS中的平滑肌细胞,参与AS的形成[4]。Glass等[5]研究认为,AS是一种自身免疫性疾病,免疫细胞、因子及免疫反应在AS的发生和发展中发挥着重要作用。
有研究发现,MSC可以向损伤的内皮募集,进一步分化为内皮细胞修复受损的血管内皮,也可通过本身的归巢作用到达血管损伤部位,参与AS的形成[6]。外源性输入的MSC可在体内分化为平滑肌细胞,参与血管再狭窄及AS的发生[7]。
本研究结果显示,同种异体BMSC经静脉移植到ApoE-/-小鼠体内后,TC、TG及LDL-C下降,且动脉粥样硬化斑块的数量及面积均有减少,提示同种异体BMSC可能具有治疗AS的作用。王治校等[8]利用MSC治疗小鼠动脉粥样硬化模型后发现,在动脉粥样硬化斑块面积减小的同时,外周血中免疫细胞数量增加,认为MSC减轻动脉粥样硬化可能与其免疫调节相关。其机制可能是BMSC可归巢到损伤部位并分化为血管细胞,同时还可分泌多种因子,促进损伤修复和抑制炎症反应。
综上所述,ApoE-/-缺陷小鼠用于动脉粥样硬化相关研究,同时同种异体BMSC可以抑制ApoE-/-动脉粥样小鼠斑块形成,改善血脂水平,延缓动脉粥样硬化进展。
表1 各组血脂水平比较(n=4)
[1] GK Hansson.Inflammation,atherosclerosis,and coronary artery disease[J].N Engl J Med,2009,352(16):429-430.
[2] 刘俊田.动脉粥样硬化发病的炎症机制的研究进展[J].西安交通大学学报(医学版),2015(2):141-152.
[3] Ross R.Atherosclerosis:an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.
[4] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:aperspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423):801-809.
[5] CK Glass,JL Witztum.Atherosclerosis:the road ahead[J].Cell,2001,104(4):503.
[6] WangCH,CherngWJ,YangNI, et al.Late-outgrowth endothelial cells attenuate intimal hyperplasia contributed by mesenchymal stem cells after vascular injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(1):54-60.
[7] Karp JM,Leng Teo GS.Mesenchymal stem cell homing:the devil is in the details[J].Cell Stem Cell,2009,4(3):206-216.
[8] 王治校,毛山,李玉,等.间充质干细胞移植对小鼠动脉粥样斑块形成的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(3):244-246.